Preżenti†Indirizz attwali: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Il-kumpless 1 tal-ġbir tad-dawl taċ-ċentru tar-reazzjoni (RC-LH1) huwa l-komponent fotosintetiku ewlieni tal-batterji fototrofiċi vjola. Introduċejna żewġ strutturi ta' mikroskopija krijo-elettronika tal-kumpless RC-LH1 minn Rhodopseudomonas palustris. L-istruttura b'riżoluzzjoni ta' 2.65 Å tal-kumpless RC-LH114-W tikkonsisti f'14-il linja tas-subunità LH1 li jdawru RC, li hija interrotta mill-proteina W, filwaqt li l-kumpless mingħajr proteina W huwa kompletament kompożizzjoni RC imdawwar minn RC. Linja LH1 magħluqa ta' 16-il subunità. It-tqabbil ta' dawn l-istrutturi jipprovdi għarfien dwar id-dinamika tal-kinone fil-kumpless RC-LH1, inklużi bidliet konformazzjonali li qabel ma kinux determinati meta l-kinone jingħaqad fis-sit RC QB, kif ukoll il-post tas-siti awżiljarji ta' rbit tal-kinone, li jgħinu biex jgħadduhom lil RC. L-istruttura unika tal-proteina W tipprevjeni l-għeluq tal-linja LH1, u b'hekk toħloq kanal biex taċċellera l-iskambju ta' quinone/quinolone.
L-enerġija pprovduta mill-fotosintesi tista' ssostni kważi l-ħajja kollha fid-dinja, u għandha potenzjal kbir għall-bijoteknoloġija solari. Filwaqt li jippromwovu l-fotosintesi globali, il-batterji fototrofiċi vjola juru wkoll diversi modi ta' enerġija u kapaċitajiet metaboliċi. Jistgħu jevitaw il-fotosintesi u jikbru bħala batterji eterotrofiċi fid-dlam, jistgħu jiffissaw in-nitroġenu u d-dijossidu tal-karbonju, jipproduċu idroġenu, u jiddegradaw komposti aromatiċi (1-3). Sabiex jipprovdu enerġija għal dawn il-proċessi, id-dawl irid jiġi kkonvertit malajr u b'mod effiċjenti f'enerġija kimika. Dan il-proċess jibda meta l-kumpless tal-antenna li jaqbad id-dawl jassorbi d-dawl u jittrasferixxi l-enerġija maqbuda liċ-ċentru ta' reazzjoni (RC), u b'hekk jibda s-separazzjoni tal-ċarġ (4-7). L-unità bażika tal-fotosintesi fil-batterji fototrofiċi vjola hija magħmula minn RC tat-tip 2, imdawwar minn kumpless 1 li jiġbor id-dawl (LH1), li jifforma l-kumpless ċentrali RC-LH1. LH1 huwa ffurmat minn firxa ta' eterodimeri αβ mgħawġa, li kull wieħed minnhom jorbot żewġ molekuli tal-klorofilla batterika (BChl) a u karotenojde wieħed jew tnejn (8-12). L-antenna LH1 l-aktar sempliċi tikkonsisti minn 16 jew 17-il eterodimeru αβ li jdawru RC (9-13) f'ċirkwit magħluq, iżda f'kumplessi ewlenin oħra, il-peptidi transmembrana jinterrompu l-kontinwità tal-LH1 tal-madwar, u b'hekk jippromwovu d-diffużjoni tal-quinol/quinone bejn RC u l-kumpless taċ-ċitokromu bc1 (11, 13-15). L-impjant fototrofiku vjola Rhodopseudomonas (Rps.) huwa organiżmu mudell li jista' jifhem it-trasferiment tal-enerġija u l-elettroni li jappoġġja l-fotosintesi. L-ewwel struttura kristallina ta' Rps. Il-mudell tal-kumpless palustris RC-LH1 huwa RC, imdawwar minn 15-il ċirkwit eterodimeriku LH1, li huma interrotti minn proteina mhux magħrufa msejħa "Protein W" (14). Protein-W ġiet sussegwentement identifikata bħala RPA4402, li hija proteina mhux karatterizzata ta' 10.5kDa bi tliet eliċi transmembrana (TMH) imbassra (16). Nipproponu li nbiddlu l-isem tal-ġene rpa4402 li jikkodifika l-proteina W għal pufW biex inkunu konsistenti man-nomenklatura użata għall-ġeni li jikkodifikaw is-subunitajiet RC-L, M (pufL, pufM) u LH1α, β (pufA, pufB). Interessanti, il-proteina-W hija preżenti biss f'madwar 10% ta' RC-LH1, li jiżvela li Rps. palustris tipproduċi żewġ kumplessi RC-LH1 differenti. Hawnhekk, nirrappurtaw l-istrutturi cryo-EM (cryo-EM) b'riżoluzzjoni għolja ta' żewġ kumplessi ewlenin, wieħed bil-proteina W u 14-il eterodimeru αβ, l-ieħor mingħajr proteina W u linja magħluqa ta' 16-il Eterodimeru LH1. L-istruttura tagħna tirrappreżenta bidla kbira fil-fehim tal-kumpless RC-LH1 ta' Rps. palustris, għaliex analizzajna l-popolazzjoni omoġenja ta' kull varjant u għandna riżoluzzjoni suffiċjenti biex nassenjaw b'mod ċar kull peptide u pigmenti marbuta u lipidi u kinoni relatati. It-tqabbil ta' dawn l-istrutturi juri li t-tliet proteini TMH-W li s'issa ma nstabux f'xi kumpless RC-LH1 ieħor jiġġeneraw kanal tal-kinona biex jaċċelleraw l-iskambju tal-kinona/kinolon. Ġew identifikati numru ta' siti ta' rbit tal-lipidi u l-kinon konservati, u żvelajna bidla konformazjonali ġdida wara l-kombinazzjoni tal-kinona u l-RC, li tista' tkun adattata għall-fotosistema II (PSII) RC ta' organiżmi fototrofiċi ossiġenati. Is-sejbiet tagħna jipprovdu għarfien ġdid dwar il-kinetika tal-irbit u l-iskambju tal-kinona/kinolon fil-kumpless ċentrali RC-LH1 ta' batterji fototrofiċi vjola.
Sabiex niffaċilitaw studju dettaljat taż-żewġ kumplessi misjuba f'Rps. palustris, iżolajna kull RC-LH1 permezz ta' metodi bijokimiċi. Il-kumpless defiċjenti fil-proteina W (minn hawn 'il quddiem imsejjaħ ΔpufW) ġie ppurifikat mir-razza li ma għandhiex il-ġene pufW (16), u jista' jiġi prodott kumpless RC-LH1 wieħed biss. Il-kumpless li fih il-proteina W huwa prodott minn razza. Il-proteina W ta' din ir-razza hija modifikata b'tikketta His 10x fit-tarf C tagħha, sabiex il-kumpless li fih il-proteina W ikun jista' jiġi kkombinat b'mod effettiv mal-biċċa l-kbira tal-proteina W nieqsa billi jiġi immobilizzat il-metall. Il-kumpless huwa separat b'mod effettiv (16) Kromatografija ta' Affinità (IMAC).
Kif muri fil-Figura 1, iż-żewġ kumplessi fihom RC bi tliet sotto-unitajiet (RC-L, RC-M u RC-H) imdawwar b'antenna LH1. L-istruttura 2.80-A tal-kumpless li m'għandux proteina-W turi 16-il eterodimeru αβ, li jiffurmaw linja LH1 magħluqa li tdawwar kompletament RC, minn hawn 'il quddiem imsejħa l-kumpless RC-LH116. L-istruttura 2.65Å tal-kumpless li fih il-proteina-W għandha 14-il eterodimeru LH1 interrott mill-proteina-W, minn hawn 'il quddiem imsejħa RC-LH114-W.
(A u B) Rappreżentazzjoni tal-wiċċ tal-kompost. (C u D) Pigmenti marbuta espressi f'vireg. (E u F) Il-kumplessi osservati mill-wiċċ ċitoplasmiku għandhom il-peptidi u s-subunitajiet LH1 rappreżentati f'cartoons, u huma nnumerati lejn l-arloġġ mid-distakk tal-proteina-W [konsistenti man-numerazzjoni Rba. kumpless sphaeroides (13)]. Għal LH1-α, il-kulur tas-subunità tal-proteina huwa isfar; għal LH1-β, il-kulur tas-subunità tal-proteina huwa blu; għal proteina-W, il-proteina hija ħamra; għal RC-H, hija ċjana; għal RC-L, hija oranġjo; għal RC-M, maġenta. Il-kofatturi huma rappreżentati minn vireg, aħdar jirrappreżenta molekuli BChl u BPh a, vjola jirrappreżenta karotenojdi, u isfar jirrappreżenta molekuli UQ10. (G u H) Veduta ingrandita tad-distakk tal-proteina-W fir-reġjun ekwivalenti tal-kumpless RC-LH114-W (G) u l-kumpless RC-LH116 (H). Il-kofattori huma murija fil-forma ta' mili tal-ispazju, il-kinone kelat huwa muri bil-blu. Id-distakk bejn il-proteina-W huwa enfasizzat b'linja blu mqattgħa f'(G), u t-toqob żgħar fejn il-kinone/kinolol jinfirex fuq iċ-ċirku LH116 huma enfasizzati b'linja sewda mqattgħa f'(H).
Figura 1 (A u B) turi l-RC imdawwar b'matriċi miftuħa jew magħluqa ta' eterodimeri LH1αβ, li kull wieħed minnhom jorbot żewġ BChl u karotenojde wieħed (Figura 1, C u D). Studji preċedenti wrew li Rps huwa l-kumpless LH1. Fil-mogħdija bijosintetika ta' spirulina xanthin, dawn l-ispeċi fihom popolazzjonijiet imħallta ta' karotenojdi (17). Madankollu, spiropyrroxanthin huwa l-karotenojde dominanti u d-densità tiegħu hija sodisfaċenti. Għalhekk, għażilna li nimmudellaw spiroxanthin fis-siti kollha ta' rbit ta' LH1. Il-polipeptidi alfa u beta huma TMHs singoli b'reġjuni qosra ta' barra tal-membrana (Figura 1, A, B, E, u F). Għalkemm id-densità ta' 17-il residwu fit-tarf C ma ġietx osservata, il-polipeptid alfa nqata' minn Met1 għal Ala46 fiż-żewġ kumplessi. Il-polipeptid β tnaqqas minn Gly4 għal Tyr52 f'RC-LH116, u minn Ser5 għal Tyr52 f'RC-LH114-W. Ma ġiet osservata l-ebda densità ta' 3 jew 4 residwi N-terminali jew 13-il residwi C-terminali (Figura S1). Analiżi tal-ispettrometrija tal-massa tal-kumpless imħallat RC-LH1 ippreparat mir-razza tat-tip selvaġġ uriet li r-reġjun nieqes kien ir-riżultat ta' qsim eterologu ta' dawn il-peptidi (Figura S1 u S2). Il-formilazzjoni N-terminali ta' α-Met1 ġiet osservata wkoll (f). L-analiżi wriet li l-α-peptide jikkonsisti minn residwi fMet1 sa Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, u l-β-peptide jikkonsisti minn residwi Ser2 sa Ala53, li huwa fi qbil tajjeb mal-mappa tad-densità EM f'temperatura baxxa.
Il-koordinazzjoni ta' α-His29 u β-His36 tagħmel il-BChls wiċċ imb'wiċċ; kull eterodimeru αβ jingħaqad mal-ġirien tiegħu biex jifforma linja miftuħa (RC-LH114-W) jew linja magħluqa (RC-LH116) madwar l-eċċiton akkoppjat ma' pigment array RC (Figura 1, C u D). Meta mqabbel mal-medda ta' 877 nm ta' RC-LH114-W, l-assorbiment red shift ta' 880 nm ta' RC-LH116 huwa ta' 3 nm (Figura 2A). Madankollu, l-ispettru ċirkolari tad-dikroiżmu huwa kważi l-istess (Figura 2B), li jindika li għalkemm hemm differenza ċara bejn linji miftuħa u magħluqa, l-ambjent lokali tal-BChls huwa simili ħafna. L-assorbiment redshift jista' jkun ir-riżultat ta' moviment termali mnaqqas u stabbiltà akbar fuq il-linja magħluqa (18, 19), il-bidla fl-akkoppjar tal-pigment ikkawżata mil-linja magħluqa (20, 21), jew taħlita ta' dawn iż-żewġ effetti (11).
(A) Spettru ta' assorbiment ultravjola/viżibbli/qrib l-infra-aħmar, li l-qċaċet tiegħu huma mmarkati bil-pigmenti korrispondenti tagħhom u normalizzati għall-qċaċet BPh f'775 nm. (B) Spettru ta' dikroiżmu ċirkolari normalizzat għall-assorbenza BChl f'805 nm. (C u D) Spettri ΔA magħżula mill-ispettri ta' assorbiment riżoluti fil-ħin tal-kumpless RC-LH114-W (C) u l-kumpless RC-LH116 (D). Għal komparabbiltà aħjar, l-ispettri kollha huma normalizzati għal ∆A ta' −A f'0.2 ps. (E) Ir-rata ta' ossidazzjoni taċ-ċitokromu c2 wara l-irradjazzjoni fil-preżenza ta' diversi konċentrazzjonijiet ta' UQ2 (ara l-Figura S8 għal dejta mhux ipproċessata). (F) F'ċelloli mkabbra taħt dawl ta' intensità baxxa, medja jew għolja (10, 30 jew 300μMm-2 s-1, rispettivament), is-subunitajiet tal-proteina W u RC-L fil-kumpless purifikat u l-proporzjon tal-membrana separata. Iddetermina l-livell tal-proteina permezz ta' elettroforesi fuq ġel SDS-polyacrylamide u immunoassay (ara l-Figura S9 għad-dejta mhux ipproċessata). Iddetermina l-proporzjon relattiv għall-kumpless purifikat RC-LH114-W. Il-proporzjon stojkjometriku ta' RC-L għal proteina-W tal-kumpless huwa 1:1.
Il-BChls fil-pożizzjoni 1 fil-linja αβ14 deformata ta' RC-LH114-W (Figura 1, A, C, u E) huma eqreb lejn id-donatur primarju RC (P) b'6.8 Å mill-BChls ekwivalenti f'RC-LH116 (Figura 1, B, D, u F, u Figura S3); madankollu, il-kinetika tal-assorbiment temporanju taż-żewġ kumplessi turi li għal RC-LH114-W u RC-LH116, il-kostanti tal-ħin tat-trasferiment tal-enerġija tal-eċitazzjoni minn LH1 għal RC huma 40 ±4 u 44 ±3 ps (Figura 2). , C u D, Figura S4 u Tabella S2). M'hemm l-ebda differenza sinifikanti fit-trasferiment elettroniku fi ħdan RC (Figura S5 u test supplimentari relatat). Nissuspettaw li l-korrispondenza mill-qrib tal-ħin tat-trasferiment tal-enerġija bejn LH1 u RC-P hija dovuta għad-distanza, l-angolu u l-enerġija potenzjali simili tal-biċċa l-kbira tal-BChl fiż-żewġ linji LH1. Jidher li l-esplorazzjoni tal-mudell tal-enerġija LH1 biex tintlaħaq id-distanza minima mhijiex aktar mgħaġġla mit-trasferiment dirett tal-enerġija minn siti subottimali għal RC. Il-linja miftuħa LH1 f'RC-LH114-W tista' wkoll tgħaddi minn moviment termali insinifikanti taħt kundizzjonijiet ta' temperatura baxxa għall-analiżi strutturali, u hemm konformazzjoni taċ-ċirku αβ14 itwal f'temperatura tal-kamra mid-distanza tal-pigmentazzjoni ta' βBChls fil-pożizzjoni ta' RC 1.
Il-kumpless RC-LH116 fih 32 BChls u 16-il karotenojde, u l-arranġament ġenerali tiegħu huwa l-istess bħal dak miksub minn Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 strain (PDB ID 7C9R) (12) u alka ħadra (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Wara l-allinjament, ġew osservati biss devjazzjonijiet żgħar fil-pożizzjonijiet tal-eterodimeri αβ, speċjalment 1-5, 15, u 16 (Figura S6). Il-preżenza tal-proteina-W għandha impatt sinifikanti fuq l-istruttura ta' LH1. It-tliet TMHs tiegħu huma konnessi permezz ta' linji qosra, bit-terminal N fuq in-naħa tal-lumen tal-kumpless u t-terminal C fuq in-naħa ċitoplasmika (Figuri 1A u 3, A sa D). Il-Proteina-W hija fil-biċċa l-kbira idrofobika (Figura 3B), u TMH2 u TMH3 jinteraġixxu ma' LH1αβ-14 biex jiffurmaw wiċċ transmembrana (Figura 3, B u E sa G). L-interfaċċja hija magħmula prinċipalment minn residwi Phe, Leu u Val fir-reġjun transmembrana. Dawn ir-residwi huma f'munzelli ta' aċidi amminiċi idrofobiċi u pigmenti αβ-14. Xi residwi polari jikkontribwixxu wkoll għall-interazzjoni, inkluż ir-rabta tal-idroġenu bejn W-Thr68 u β-Trp42 fuq il-wiċċ tal-kavità kumplessa (Figura 3, F u G). Fuq il-wiċċ taċ-ċitoplasma, Gln34 hija biswit il-grupp keto tal-karotenojdi αβ-14. Barra minn hekk, il-molekula n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) ġiet solvuta, u d-denb idrofobiku tagħha estiż għall-interfaċċja bejn il-proteina-W u αβ-14, u d-denb tal-lipidi jista' jkun jinsab fil-ġisem. Innotajna wkoll li r-reġjuni ta' riżoluzzjoni C-terminali tal-proteina W u RCH huma qrib ħafna, iżda mhux fl-ambitu tal-formazzjoni ta' interazzjonijiet speċifiċi (Figura 1, A u E). Madankollu, jista' jkun hemm interazzjonijiet fl-aċidi amminiċi C-terminali mhux solvuti ta' dawn iż-żewġ proteini, li jistgħu jipprovdu mekkaniżmu għar-reklutaġġ tal-proteina W waqt l-assemblaġġ tal-kumpless RC-LH114-W.
(A) Il-Proteina-W, li tħares lejn l-interfaċċja ma' LH1αβ14 f'forma ta' kartun, għandha katina tal-ġenb forma ta' virga (ħamra), murija f'parti mid-dijagramma tal-potenzjal elettrostatiku (wiċċ griż trasparenti b'livell ta' kontorn ta' 0.13). (B) Il-Proteina-W rappreżentata minn wiċċ ikkulurit idrofobiku. Żoni polari u ċċarġjati huma murija b'ċjan, żoni idrofobiċi huma murija bl-abjad, u żoni idrofobiċi qawwija huma murija bl-oranġjo. (Ċ u D) Il-Proteina-W rappreżentata f'kartun, l-orjentazzjoni tagħha hija l-istess bħal f'(A) (Ċ), u mdawra b'180° (D). Skont il-pożizzjoni fis-sekwenza, ir-residwi distinti jadottaw skema ta' kuluri tal-qawsalla, fejn in-N-terminal huwa blu u s-C-terminal huwa aħmar. (E) Il-Proteina-W fl-istess veduta bħal f'(A), u r-residwi fl-interfaċċja tal-proteina-W:LH1 huma rappreżentati minn vireg b'marki mwaħħlin. (F) Il-Proteina-W hija mdawra 90° relattiva għal (E) u LH1αβ14 fir-rappreżentazzjoni tal-kartuns, u relattiva għar-residwi tal-interfaċċja fir-rappreżentazzjoni tal-vireg. Ir-residwi li jisporġu mill-polipeptid beta huma ttikkettjati. Il-kofattur huwa muri bħala vireg li jaqbel mal-kulur tal-Figura 1, il-β-DDM dekompost huwa muri bil-griż, u l-ossiġnu huwa muri bl-aħmar. (G) Il-veduta f'(F) hija mdawra 180°, bir-residwi prominenti tal-polipeptid alfa ttikkettjat.
Il-Proteina-W tissostitwixxi eterodimeru αβ (il-15 fil-Figura 1F), u b'hekk tipprevjeni l-għeluq tal-linja u tmejjel l-ewwel tliet eterodimeri αβ. Ġie osservat li l-angolu massimu ta' inklinazzjoni tal-ewwel eterodimeru αβ-1 relattiv għan-normali tal-film kien ta' 25° sa 29° (Figura 1, A u E), li kien iffurmat mill-inklinazzjoni ta' 2° sa 8° ta' αβ-1 f'RC A kuntrast qawwi-LH116 (Figura 1, B u F). It-tieni u t-tielet eterodimeri huma inklinati minn 12° sa 22° u minn 5° sa 10°, rispettivament. Minħabba l-ostaklu steriku ta' RC, l-inklinazzjoni ta' αβ-1 ma tinkludix it-tieni par ta' αβ (li jikkorrispondi għas-16-il αβ fil-Figura 1F), u b'hekk tifforma vojt ċar fiċ-ċirku LH1 (Figura 1, A u E). Minħabba n-nuqqas ta' żewġ eterodimeri αβ, akkumpanjat mit-telf ta' erba' BChl u żewġ karotenojdi, l-ebda wieħed mill-karotenojdi ma jorbot mas-subunità αβ-1 mibruma, li jirriżulta f'ċirku LH114-W li fih 13-il karotenojd Veġetarjan u 28 BChls. L-istimi tar-riżoluzzjoni lokali taż-żewġ kumplessi fir-reġjuni αβ1 sa 7 huma aktar baxxi minn dawk tal-bqija tal-linja LH1, li jistgħu jirriflettu l-plastiċità inerenti tas-subunità LH1 biswit is-sit RC QB (Figura 4).
L-istampi ta' RC-LH114-W (A u B) u RC-LH116 (C u D) huma murija mill-istess veduta minn fuq/veduta tal-ġenb (A u B) (A u C) u l-wiċċ tal-kavità tal-Fig. 1. (B u D). Iċ-ċwievet ikkuluriti huma murija fuq il-lemin.
L-uniku kumpless ċentrali karatteristiku ieħor b'proporzjon stojkjometriku ta' 1:14 huwa d-dimeru Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Madankollu, il-proteina W u PufX m'għandhom l-ebda omoloġija ovvja, u għandhom impatt sinifikanti fuq l-istrutturi LH1 rispettivi tagħhom. PufX huwa TMH wieħed b'dominju ċitoplasmiku N-terminali li jinteraġixxi man-naħa ċitoplasmika tas-subunità RC-H (13) f'pożizzjoni li tikkorrispondi għal Rps. palustris LH116αβ-16. PufX joħloq kanal għall-iskambju ta' quinone/quinone bejn RC-LH1 u l-kumpless taċ-ċitokromu bcl u huwa preżenti fil-kumpless ċentrali kollu ta' Rba. sphaeroides (13). Għalkemm l-interfaċċja monomeru-monomeru tinsab f'Rba. Id-dimeru sphaeroides RC-LH1-PufX jinsab fil-pożizzjoni ta' rbit tal-proteina W f'RC-LH114-W, u d-distakk indott minn PufX u l-proteina-W jinsab f'pożizzjoni ekwivalenti (Figura S7A). Id-distakk f'RC-LH114-W huwa wkoll allinjat mal-kanal ipotetiku tal-kinone (8) ta' Pseudomonas rosea LH1, li huwa ffurmat minn peptidi mhux relatati mal-proteina W jew PufX (Figura S7B). Barra minn hekk, il-kanal tal-kinone f'Blc. L-LH1 aħdar żmerald iffurmat bl-esklużjoni ta' subunità γ waħda (7) jinsab f'pożizzjoni simili (Figura S7C). Għalkemm medjat minn proteini differenti, id-dehra ta' dawn il-kanali tal-kinone/kinolol f'pożizzjoni komuni fil-kumpless RC-LH1 tidher li hija eżempju ta' evoluzzjoni konverġenti, li tindika li d-distakk maħluq mill-proteina W jista' jaġixxi bħala kanal tal-kinone.
Id-distakk fil-linja LH114-W jippermetti l-formazzjoni ta' reġjun kontinwu tal-membrana bejn l-ispazju intern tal-kumpless RC-LH114-W u l-membrana tal-massa (Figura 1G), aktar milli jgħaqqad iż-żewġ dominji permezz ta' poru tal-proteina bħal fil-proteini. Il-kumpless RC-LH116 huwa simili għal kumpless magħluq bħal labra Tch. (22) (Figura 1H). Peress li d-diffużjoni tal-kinone mill-membrana hija aktar mgħaġġla mid-diffużjoni mill-kanal dejjaq tal-proteina, il-linja miftuħa LH114-W tista' tippermetti tibdil tal-RC aktar mgħaġġel mil-linja magħluqa LH116, u d-diffużjoni tal-kinone fl-RC tista' tkun aktar ristretta. Sabiex nittestjaw jekk il-proteina W taffettwax il-konverżjoni tal-kinoni permezz tal-RC, wettaqna assay ta' ossidazzjoni taċ-ċitokromu fuq ċerta konċentrazzjoni ta' ubiquinone 2 (UQ2) (analogu tal-UQ10 naturali b'denb tal-isoprene iqsar) (Figura 2E). Għalkemm il-preżenza ta' kinon kelat tfixkel id-determinazzjoni preċiża tal-kostanti apparenti ta' Michaelis (RC-LH114-W u RC-LH116 huma adattati għal 0.2±0.1μM u 0.5±0.2μM, rispettivament), ir-rata massima ta' RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) hija 28±5% akbar minn RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Inizjalment stmajna li l-proteina-W hija preżenti f'madwar 10% tal-kumpless ċentrali (16); hawnhekk, ir-rati ta' okkupazzjoni taċ-ċelloli tat-tkabbir f'dawl baxx, dawl medju, u dawl għoli huma 15±0.6%, 11±1% u 0.9±0.5, rispettivament % (Figura 2F). Paragun kwantitattiv tal-ispettrometrija tal-massa wera li ż-żieda tat-tikketta tal-istidina ma naqqsitx l-abbundanza relattiva tal-proteina-W meta mqabbla mar-razez tat-tip selvaġġ (P = 0.59), għalhekk dawn il-livelli mhumiex artefatt ta' proteina-W modifikata (Figura S10). Madankollu, din l-okkupazzjoni baxxa tal-proteina-W fil-kumpless RC-LH1 tista' tippermetti lil xi RCs jinqalbu b'rata aċċellerata, u b'hekk itaffu l-iskambju aktar bil-mod ta' quinone/quinolone fil-kumpless RC-LH116. Innotajna li r-rata għolja ta' okkupazzjoni tad-dawl mhijiex konsistenti mad-dejta traskrittomika reċenti, li tindika li l-espressjoni tal-ġene pufW tiżdied taħt dawl qawwi (Figura S11) (23). Id-differenza bejn it-traskrizzjoni ta' pufW u l-inkorporazzjoni ta' proteina-W fil-kumpless RC-LH1 hija konfuża u tista' tirrifletti r-regolazzjoni kumplessa tal-proteina.
F'RC-LH114-W, 6 kardjolipini (CDL), 7 fosfatidilkolini (POPC), 1 fosfatidilgliċerol (POPG) u 29 molekula β-DDM huma allokati u mmudellati fiha 6 CDLs, 24 POPCs, 2 POPGs u 12 βDDMs. RC-LH116 (Figura 5, A u B). F'dawn iż-żewġ strutturi, is-CDL kważi tinsab fuq in-naħa ċitoplasmika tal-kumpless, filwaqt li POPC, POPG u β-DDM jinsabu l-aktar fuq in-naħa luminali. Żewġ molekuli lipidiċi u deterġenti ġew iżolati fir-reġjun αβ-1 sa αβ-6 tal-kumpless RC-LH114-W (Figura 5A), u ħamsa ġew iżolati fir-reġjun ekwivalenti ta' RC-LH116 (Figura 5B). Instabu aktar lipidi fuq in-naħa l-oħra tal-kumpless, prinċipalment CDL, akkumulati bejn RC u αβ-7 sa αβ-13 (Figura 5, A u B). Lipidi u deterġenti oħra strutturalment solvuti jinsabu barra ċ-ċirku LH1, u ktajjen aċiliċi solvuti sew jestendu bejn is-subunitajiet LH1, tentattivament nominati bħala β-DDM f'RC-LH114-W, u definiti bħala β-DDM f'RC Taħlita ta' β-DDM u POPC-LH116. Il-pożizzjonijiet simili ta' lipidi u deterġenti kelanti fl-istruttura tagħna jindikaw li huma siti ta' rbit fiżjoloġikament rilevanti (Figura S12A). Il-pożizzjonijiet ta' molekuli ekwivalenti f'Tch għandhom ukoll konsistenza tajba. Gentle and Trv. Strain 970 RC-LH1s (Figura S12, B sa E) (9, 12) u r-residwi ta' rbit tal-idroġenu tal-grupp tar-ras tal-lipidi wrew konservazzjoni pjuttost tajba fl-allinjament tas-sekwenza (Figura S13), li jindika li CDL ikkonservata li torbot ma' RC (24), dawn is-siti jistgħu jiġu kkonservati fil-kumpless RC-LH1.
(A u B) Il-peptidi RC-LH114-W (A) u RC-LH116 (B) huma rappreżentati minn cartoons, u l-pigmenti huma rappreżentati minn vireg, bl-użu tal-iskema tal-kuluri fil-Figura 1. Il-lipidi huma murija bl-aħmar, u d-deterġenti huma murija bil-griż. UQ marbuta mas-siti RC QA u QB hija isfar, filwaqt li UQ iżolata hija blu. (Ċ u D) L-istess veduti bħal (A) u (B), bil-lipidi mħollija barra. (E sa G) Veduta mkabbra ta' Q1(E), Q2(F) u Q3(G) minn RC-LH116, b'katini tal-ġenb li jinfluwenzaw lil xulxin. Il-bonds tal-idroġenu huma murija bħala linji suwed imqattgħin.
F'RC-LH116, kemm RC QA kif ukoll QB UQ, li jipparteċipaw fit-trasferiment tal-elettroni fil-proċess ta' separazzjoni tal-ċarġ, huma dekomposti fis-siti ta' rbit tagħhom. Madankollu, f'RC-LH114-W, il-kinone QB ma ġietx solvuta u se tiġi diskussa fid-dettall hawn taħt. Minbarra l-kinoni QA u QB, żewġ molekuli UQ kelati (li jinsabu bejn iċ-ċrieki RC u LH1) huma allokati fl-istruttura RC-LH114-W skont il-gruppi tar-ras solvuti sew tagħhom (li jinsabu f'Q1 u Q2, rispettivament). spazju). Figura 5C). Żewġ unitajiet ta' isoprene huma assenjati lil Q1, u l-mappa tad-densità tirriżolvi ​​l-10 dnub tal-isoprene kompluti ta' Q2. Fl-istruttura ta' RC-LH116, tliet molekuli UQ10 kelati (Q1 sa Q3, Figura 5D) ġew solvuti, u l-molekuli kollha għandhom densità ċara mad-denb kollu (Figura 5, D sa G). Fiż-żewġ strutturi, il-pożizzjonijiet tal-gruppi tar-ras tal-kinone ta' Q1 u Q2 għandhom konsistenza eċċellenti (Figura S12F), u jinteraġixxu biss ma' RC. Q1 jinsab fid-daħla tad-distakk W ta' RC-LH114-W (Figura 1G u 5, C, D u E), u Q2 jinsab ħdejn is-sit ta' rbit ta' QB (Figura 5, C, D) u F). Ir-residwi konservati ta' L-Trp143 u L-Trp269 huma qrib ħafna ta' Q1 u Q2 u jipprovdu interazzjonijiet potenzjali ta' π-stacking (Figura 5, E u F, u Figura S12). L-Gln88, 3.0 Å mill-ossiġnu distali ta' Q1, jipprovdi rabta qawwija ta' idroġenu (Figura 5E); dan ir-residwu huwa konservat fl-RCs kollha ħlief l-aktar relazzjoni distanti (Figura S13). L-Ser91 huwa sostitwit b'mod konservattiv għal Thr fil-biċċa l-kbira tal-RCs l-oħra (Figura S13), huwa 3.8 Angstroms mill-ossiġnu tal-metil ta' Q1, u jista' jipprovdi bonds tal-idroġenu dgħajfa (Figura 5E). Q3 ma jidhirx li għandu interazzjoni speċifika, iżda jinsab fir-reġjun idrofobiku bejn is-subunità RC-M u s-subunità LH1-α 5 sa 6 (Figura 5, D u G). Q1, Q2 u Q3 jew kinoni kelati fil-qrib ġew ukoll riżolti f'Tch. Gentle, Trv. Strain 970 u Blc. L-istruttura tal-iris (9, 10, 12) tipponta lejn sit ta' rbit tal-kinone awżiljarju konservat fil-kumpless RC-LH1 (Figura S12G). Il-ħames UQs dekomposti f'RC-LH116 huma fi qbil tajjeb mal-5.8±0.7 ta' kull kumpless determinat permezz ta' kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja (HPLC), filwaqt li t-tliet UQs dekomposti f'RC-LH114-W huma aktar baxxi minn. Il-valur imkejjel ta' 6.2±0.3 (Fig. S14) jindika li hemm molekuli UQ mhux solvuti fl-istruttura.
Il-polipeptidi psewdo-simmetriċi L u M kull wieħed fihom ħames TMHs u jiffurmaw eterodimeru li jikkombina dimeru BChl wieħed, żewġ monomeri BChl, żewġ monomeri batterjofaġi (BPh), u ħadid mhux Heme wieħed u molekula jew tnejn UQ10. Permezz tal-preżenza ta' bonds tal-idroġenu fuq il-grupp terminali tal-ketone u l-akkumulazzjoni magħrufa tiegħu f'Rps, il-karotenojdi huma inkorporati fis-subunità M, li tissejjaħ cis-3,4-dehydroorhodopin. Speċi (25). Id-dominju tal-membrana ta' barra ta' RC-H huwa ankrat mal-membrana minn TMH wieħed. L-istruttura ġenerali RC hija simili għat-tliet subunitajiet RC ta' speċi relatati (bħal Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Il-makroċikli ta' BChl u BPh, is-sinsla tal-karotenojdi u l-ħadid mhux heme jikkoinċidu fil-medda ta' riżoluzzjoni ta' dawn l-istrutturi, kif ukoll il-grupp tar-ras UQ10 fis-sit QA u l-kinone QB f'RC-LH116 (Figura S15).
Id-disponibbiltà ta' żewġ strutturi RC b'rati differenti ta' okkupazzjoni tas-sit QB tipprovdi opportunità ġdida biex jiġu eżaminati l-bidliet konformazjonali konsistenti li jakkumpanjaw l-irbit tal-quinone QB. Fil-kumpless RC-LH116, il-quinone QB jinsab fil-pożizzjoni "prossimali" marbuta għalkollox (26), iżda s-separazzjoni ta' RC-LH114-W m'għandhiex quinone QB. M'hemm l-ebda quinone QB f'RC-LH114-W, li huwa sorprendenti għaliex il-kumpless huwa attiv, aktar mill-kumpless RC-LH116 bil-quinone QB strutturalment riżolut. Għalkemm iż-żewġ ċrieki LH1 jikkelaw madwar sitt quinones, ħamsa huma strutturalment riżoluti fiċ-ċirku magħluq RC-LH116, filwaqt li tlieta biss huma strutturalment limitati fiċ-ċirku miftuħ RC-LH114-W. Dan id-diżordni strutturali miżjud jista' jirrifletti s-sostituzzjoni aktar mgħaġġla tas-siti QB RC-LH114-W, kinetika aktar mgħaġġla tal-quinone fil-kumpless, u probabbiltà akbar li taqsam il-linja LH1. Nissuġġerixxu li n-nuqqas ta' UQ fis-sit RC QB ta' RC-LH114-W jista' jkun ir-riżultat ta' kumpless aktar kumpless u aktar attiv, u s-sit QB ta' RC-LH114-W ġie immedjatament iffriżat fit-tibdil tal-UQ. L-istadju speċifiku (id-daħla għas-sit QB ingħalaq) jirrifletti l-konformazzjoni ta' din l-attività.
Mingħajr QB, ir-rotazzjoni li takkumpanja ta' L-Phe217 għal pożizzjoni li mhijiex kompatibbli mar-rabta tal-UQ10, għaliex se tikkawża ħabta spazjali mal-ewwel unità tal-isoprene tad-denb (Figura 6A). Barra minn hekk, il-bidliet konformazjonali ewlenin ovvji huma ovvji, speċjalment l-eliċi de (eliċi qasira fil-linja bejn TMH D u E) fejn L-Phe217 jiġi mċaqlaq lejn il-but tar-rabta tal-QB u r-rotazzjoni ta' L-Tyr223 (Figura 6A) biex tinkiser ir-rabta tal-idroġenu mal-qafas M-Asp45 u tagħlaq id-daħla tas-sit tar-rabta tal-QB (Figura 6B). L-eliċi de tiddawwar fil-bażi tagħha, is-Cα ta' L-Ser209 jiġi mċaqlaq b'0.33 Å, filwaqt li l-L-Val221Cα jiġi mċaqlaq bi 3.52 Å. M'hemm l-ebda bidliet osservabbli f'TMH D u E, li huma superpożibbli fiż-żewġ strutturi (Figura 6A). Safejn nafu aħna, din hija l-ewwel struttura fl-RC naturali li tagħlaq is-sit QB. Paragun mal-istruttura kompluta (marbuta mal-QB) juri li qabel ma l-kinone jitnaqqas, hija meħtieġa bidla konformazzjonali biex tidħol fil-kinone. L-Phe217 idur biex jifforma interazzjoni ta' π-stacking mal-grupp tar-ras tal-kinone, u l-elika tiċċaqlaq 'il barra, u b'hekk l-iskeletru ta' L-Gly222 u l-katina tal-ġenb ta' L-Tyr223 jiffurmaw netwerk ta' bonds tal-idroġenu bi struttura stabbli ta' bonds tal-idroġenu (Figura 6, A u C).
(A) Disinn ologrammatiku sovrappost (katina L, katina oranġjo/M, maġenta) u struttura apo (griża), fejn ir-residwi ewlenin huma murija fil-forma ta' rappreżentazzjoni bħal virga. UQ10 hija rappreżentata minn strixxa safra. Il-linja bit-tikek tindika l-bonds tal-idroġenu ffurmati fl-istruttura kollha. (B u C) Ir-rappreżentazzjoni tal-wiċċ tal-apolipoproteina u l-istruttura taċ-ċirku kollha, li tenfasizza l-ossiġnu tal-katina tal-ġenb ta' L-Phe217 bil-blu u L-Tyr223 bl-aħmar, rispettivament. Is-subunità L hija oranġjo; is-subunitajiet M u H mhumiex ikkuluriti. (D u E) Apolipoproteina (D) u siti RC QB sħaħ (E) [ikkuluriti b'(A) rispettivament] u Thermophilus thermophilus PSII (aħdar, blu b'kinone tal-plastik; PDB ID: 3WU2) Allinja (58).
B'mod mhux mistenni, għalkemm diversi strutturi ta' RCs defiċjenti fil-QB mingħajr LH1 huma disponibbli, il-bidliet konformazjonali osservati f'dan l-istudju ma ġewx irrappurtati qabel. Dawn jinkludu l-istruttura tat-tnaqqis tal-QB minn Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) u Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), li kollha huma kważi l-istess bħall-istruttura ġenerali tal-QB tagħhom. Spezzjoni mill-qrib ta' 3PRC żvelat li l-molekuli tad-deterġent LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) jorbtu fid-daħla tal-pożizzjoni QB, li jista' jipprevjeni r-riarranġament f'konformazzjoni magħluqa. Għalkemm LDAO ma jiddekomponix fl-istess pożizzjoni f'1EYS jew 1OGV, dawn l-RCs huma ppreparati bl-użu tal-istess deterġent u għalhekk jistgħu jipproduċu l-istess effett. L-istruttura kristallina ta' Rba. Sphaeroides RC ko-kristallizzat ma' cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) jidher ukoll li għandu sit QB magħluq. Madankollu, f'dan il-każ, ir-reġjun N-terminal tal-polipeptid RC-M (li jinteraġixxi mas-sit ta' rbit QB permezz tal-bond H tar-residwu Tyr fuq l-elika Q) jadotta konformazzjoni mhux naturali, u l-bidla konformazzjonali QB mhijiex esplorata aktar (30). Dak li huwa ta' serħan il-moħħ huwa li ma rajniex dan it-tip ta' deformazzjoni tal-polipeptid M fl-istruttura RC-LH114-W, li hija kważi l-istess bħar-reġjun N-terminal ta' RC-LH116 RC. Ta' min jinnota wkoll li wara l-qerda tal-antenna LH1 ibbażata fuq id-deterġent, l-apolipoprotein RCs fil-PDB ġew solvuti, li elimina l-pools interni ta' quinone u l-lipidi fid-distakk bejn l-RC u l-wiċċ ta' ġewwa taċ-ċirku LH1 tal-madwar (31, 32). RC jibqa' funzjonali għax iżomm il-kofatturi kollha, ħlief għall-kinona QB li tista' tiddikomponi, li hija inqas stabbli u ħafna drabi tintilef matul il-proċess ta' preparazzjoni (33). Barra minn hekk, huwa magħruf li t-tneħħija ta' LH1 u lipidi ċikliċi naturali minn RC jista' jkollha impatt fuq il-funzjonijiet, bħall-ħajja mqassra tal-istat P+QB separat bil-ċarġ (31, 34, 35). Għalhekk, nissuspettaw li l-eżistenza taċ-ċirku LH1 lokali li jdawwar l-RC tista' żżomm is-sit QB "magħluq", u b'hekk tippreserva l-ambjent lokali ħdejn il-QB.
Għalkemm l-apolipoproteina (mingħajr il-kinona QB) u l-istruttura kompluta jirrappreżentaw biss żewġ snapshots tat-tibdil tas-sit QB, aktar milli serje ta' avvenimenti, hemm indikazzjonijiet li r-rabta tista' tiġi kkontrollata biex tipprevjeni r-rabta mill-ġdid mill-idrokinona biex tinibixxi l-inibizzjoni tas-sottostrat. L-interazzjoni tal-kinolol u l-kinona ħdejn is-sit QB tal-apolipoproteina tista' tkun differenti, u dan iwassal għar-rifjut tagħha mill-RC. Ilu jiġi propost li l-bidliet konformazjonali għandhom rwol fir-rabta u t-tnaqqis tal-kinoni. Il-kapaċità tal-RCs iffriżati li jnaqqsu l-kinoni wara adattament fid-dlam hija indebolita (36); il-kristallografija bir-raġġi-X turi li din il-ħsara hija dovuta għall-fatt li l-kinoni QB huma maqbuda f'konformazzjoni "distali" madwar 4.5 Å mill-pożizzjoni prossimali attiva (26), 37). Nissuġġerixxu li din il-konformazzjoni tar-rabta distali hija snapshot tal-istat intermedju bejn l-apolipoproteina u l-istruttura taċ-ċirku sħiħ, li ssegwi l-interazzjoni inizjali mal-kinona u l-ftuħ tas-sit QB.
L-RC tat-tip II li tinsab fil-kumpless PSII ta’ ċerti batterji fototrofiċi u ċjanobatterji, alka u pjanti għandha konservazzjoni strutturali u funzjonali (38). L-allinjament strutturali muri fil-Figura 6 (D u E) jenfasizza x-xebh bejn l-RCs tal-PSII u s-sit QB tal-kumpless RC batterjali. Dan it-tqabbil ilu żmien twil mudell għall-istudju tas-sistemi relatati mill-qrib ta’ rbit u tnaqqis tal-kinoni. Pubblikazzjonijiet preċedenti ssuġġerew li l-bidliet konformazzjonali huma akkumpanjati minn tnaqqis tal-PSII tal-kinoni (39, 40). Għalhekk, meta wieħed iqis il-konservazzjoni evoluzzjonarja tal-RC, dan il-mekkaniżmu ta’ rbit li qabel ma kienx osservat jista’ jkun applikabbli wkoll għas-sit QB tal-RC tal-PSII f’pjanti fototrofiċi ossiġenati.
Ir-razez Rps ΔpufW (tħassir ta' pufW mhux immarkat) u PufW-His (proteina-W immarkata b'10x His fit-tarf C-terminali espressa mil-locus naturali ta' pufW). palustris CGA009 ġie deskritt fix-xogħol preċedenti tagħna (16). Dawn ir-razez u l-ġenitur iżoġeniku tat-tip selvaġġ ġew irkuprati mill-friża billi tqassmu numru żgħir ta' ċelloli fuq pjanċa PYE (kull waħda 5 g litru -1) (maħżuna f'LB f'-80 °C, li fiha 50% (w/v) proteina gliċerol), estratt tal-ħmira u agar succinate) [1.5% (w/v)]. Il-pjanċa ġiet inkubata matul il-lejl fid-dlam f'temperatura tal-kamra taħt kundizzjonijiet anerobiċi, u mbagħad illuminata b'dawl abjad (~50 μmolm-2 s-1) ipprovdut minn bozoz aloġeni OSRAM 116-W (RS Components, UK) għal 3 sa 5 ijiem sakemm dehret kolonja waħda. Kolonja waħda ntużat biex titlaqqam 10 ml ta' mezz M22+ (41) supplimentat b'0.1% (w/v) aċidi każamino (minn hawn 'il quddiem imsejħa M22). Il-kultura tkabbret f'kundizzjonijiet ta' ossiġnu baxx fid-dlam f'temperatura ta' 34°C b'tħawwid ta' 180 rpm għal 48 siegħa, u mbagħad 70 ml tal-kultura ġiet inokulata fl-istess kundizzjonijiet għal 24 siegħa. Kultura semi-aerobika b'volum ta' 1 ml tintuża biex titlaqqam 30 ml ta' mezz M22 fi flixkun tal-ħġieġ trasparenti b'tapp bil-kamin universali ta' 30 ml u ġiet irradjata b'aġitazzjoni (~50μmolm-2 s-1) għal 48 siegħa permezz ta' virga tat-tħawwid manjetika sterili. Imbagħad 30 ml tal-kultura ġiet inokulata b'madwar litru wieħed ta' kultura fl-istess kundizzjonijiet, li mbagħad intużat biex titlaqqam madwar 9 litri ta' kultura mdawla f'temperatura ta' ~200 μmolm-2 s-1 għal 72 siegħa. Iċ-ċelloli nġabru permezz ta' ċentrifugazzjoni f'7132 RCF għal 30 minuta, ġew sospiżi mill-ġdid f'~10 ml ta' 20 mM tris-HCl (pH 8.0), u nħażnu f'-20°C sakemm kienu meħtieġa.
Wara li jdub, żid xi kristalli ta' deoxyribonuclease I (Merck, UK), lysozyme (Merck, UK) u żewġ pilloli ta' inibitur tal-protease tal-oloenzima Roche (Merck, UK) maċ-ċelloli sospiżi mill-ġdid. F'ċellula ta' pressjoni Franċiża ta' 20,000 psi (Aminco, USA), iċ-ċelloli ġew imfarrka minn 8 sa 12-il darba. Wara li tneħħew iċ-ċelloli mhux imkissra u l-fdalijiet insolubbli permezz ta' ċentrifugazzjoni f'18,500 RCF għal 15-il minuta f'4°C, il-membrana ġiet preċipitat mil-liżat pigmentat permezz ta' ċentrifugazzjoni f'113,000 RCF għal sagħtejn f'43,000°C. Armi l-frazzjoni solubbli u erġa' ssospendi l-membrana kkulurita f'100 sa 200 ml ta' 20 mM tris-HCl (pH 8.0) u omoġenizza sakemm ma jkunx hemm aggregati viżibbli. Il-membrana sospiża ġiet inkubata f'20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) li kien fih 2% (w/v) β-DDM għal siegħa fid-dlam f'4°C b'taħwid ġentili. Imbagħad iċċentrifuga f'70°C biex tħoll 150,000 RCF f'4°C għal siegħa biex tneħħi l-insolubbli residwi.
Il-membrana solubilizzanti mir-razza ΔpufW ġiet applikata għal kolonna ta' skambju joniku DEAE Sepharose ta' 50 ml bi tliet volumi ta' kolonna (CV) ta' buffer ta' rbit [20 mM tris-HCl (pH 8.0) li fih 0.03% (w/v) β-DDM]. Aħsel il-kolonna b'żewġ buffers ta' rbit CV, u mbagħad aħsel il-kolonna b'żewġ buffers ta' rbit li fihom 50 mM NaCl. Il-kumpless RC-LH116 ġie eluż b'gradjent lineari ta' 150 sa 300 mM NaCl (f'buffer ta' rbit) fuq 1.75 CV, u l-kumpless ta' rbit li jifdal ġie eluż b'buffer ta' rbit li fih 300 mM NaCl fuq 0.5 CV. Iġbor l-ispettru tal-assorbiment bejn 250 u 1000 nm, żomm il-frazzjoni b'proporzjon ta' assorbenza (A880/A280) akbar minn 1 f'880 sa 280 nm, iddilwixxiha darbtejn fil-bafer tal-irbit, u uża l-istess proċedura mill-ġdid fuq il-kolonna DEAE. Iddilwixxi l-frazzjonijiet b'proporzjonijiet A880/A280 ogħla minn 1.7 u proporzjonijiet A880/A805 ogħla minn 3.0, wettaq it-tielet rawnd ta' skambju ta' joni, u żomm il-frazzjonijiet b'proporzjonijiet A880/A280 ogħla minn 2.2 u proporzjonijiet A880/A805 ogħla minn 5.0. Il-kumpless parzjalment purifikat ġie kkonċentrat għal ~2 ml f'filtru ċentrifugali Amicon 100,000 molekulari weight cut-off (MWCO) (Merck, UK), u mgħobbi fuq kolonna ta' esklużjoni tad-daqs Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) li fiha 200 mM NaCl buffer, u mbagħad eluż fl-istess buffer b'1.5 CV. Iġbor l-ispettri tal-assorbiment tal-frazzjoni ta' esklużjoni tad-daqs, u kkonċentra l-ispettri tal-assorbiment b'proporzjonijiet A880/A280 'il fuq minn 2.4 u proporzjonijiet A880/A805 'il fuq minn 5.8 sa 100 A880, u użahom immedjatament għall-preparazzjoni jew il-ħażna tal-grilja cryo-TEM. Żomm f'-80°C sakemm ikun hemm bżonn.
Il-membrana solubilizzanti mir-razza PufW-His ġiet applikata għal kolonna HisPrep FF Ni-NTA Sepharose ta' 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8.0) li fiha 200 mM NaCl u 0.03% (w/w)) f'buffer IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. Il-kolonna nħaslet b'ħames CVs ta' buffer IMAC, u mbagħad b'ħames CVs ta' buffer IMAC li fih 10 mM histidine. Il-kumpless ċentrali tneħħa mill-kolonna b'ħames buffers IMAC li fihom 100 mM histidine. Il-frazzjoni li fiha l-kumpless RC-LH114-W hija kkonċentrata għal ~10 ml f'tank imħawwad mgħammar b'filtru Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK), dilwita 20 darba b'buffer li jgħaqqad, u mbagħad miżjuda ma' 25 ml. Fil-kolonna DEAE Sepharose, erba' CVs marbuta mal-buffer jintużaw minn qabel. Aħsel il-kolonna b'erba' buffers ta' rbit CV, imbagħad elużi l-kumpless fuq tmien CVs fuq gradjent lineari ta' 0 sa 100 mM NaCl (f'buffer ta' rbit), u l-erba' CVs li jifdal fihom 100 mM buffer ta' rbit. Il-kumplessi residwi elużi fuq il-klorur tas-sodju flimkien mal-proporzjon A880/A280 ogħla minn 2.4 u l-proporzjon A880/A805 ogħla minn 4.6 frazzjonijiet ġew ikkonċentrati għal ~2 ml f'filtru ċentrifugali Amicon 100,000 MWCO, u mtlew b'1.5 CV IMAC minn qabel b'kolonna ta' esklużjoni tad-daqs Superdex 200 16/600 ekwilibrata b'Buffer, u mbagħad elużi fl-istess buffer fuq 1.5 CV. Iġbor l-ispettri tal-assorbiment tal-frazzjonijiet ta' esklużjoni tad-daqs u kkonċentra l-ispettri tal-assorbiment b'proporzjonijiet A880/A280 'il fuq minn 2.1 u proporzjonijiet A880/A805 'il fuq minn 4.6 sa 100 A880, li jintużaw immedjatament għall-preparazzjoni tal-grilja TEM iffriżata jew jinħażnu f'-80°C sakemm ikun hemm bżonn.
Friżer tal-immersjoni Leica EM GP intuża biex jipprepara grilji TEM f'temperatura baxxa. Il-kumpless ġie dilwit f'buffer IMAC għal A880 ta' 50, u mbagħad 5μl ġew mgħobbija fuq xibka tar-ram miksija bil-karbonju QUANTIFOIL 1.2/1.3 li għadha kif ġiet skarikata bil-glow (Agar Scientific, UK). Inkuba l-grilja f'20°C u 60% umdità relattiva għal 30 sekonda, imbagħad nixxefha għal 3 sekondi, u mbagħad itfiha f'etan likwidu f'-176°C.
Id-dejta tal-kumpless RC-LH114-W ġiet irreġistrata fuq l-eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) b'mikroskopju Titan Krios, li jaħdem b'vultaġġ ta' aċċelerazzjoni ta' 300kV, b'ingrandiment nominali ta' 130,000× u enerġija ta' - Agħżel vojt ta' 20 eV. Gatan 968 GIF Quantum b'ditekter tal-quċċata K2 intuża biex jirreġistra immaġini fil-modalità tal-għadd biex jiġbor id-dejta. Id-daqs tal-pixel kalibrat huwa 1.048Å, u r-rata tad-doża hija 3.83 e-Å-2s-1. Il-film inġabar fi 11-il sekonda u qasmu f'40 parti. Uża ż-żona miksija bil-karbonju biex terġa' tiffoka l-mikroskopju, u mbagħad iġbor tliet films għal kull toqba. B'kollox, inġabru 3130 film, b'valuri ta' defocus bejn -1 u -3μm.
Id-dejta għall-kumpless RC-LH116 inġabret bl-użu tal-istess mikroskopju fil-Laboratorju tal-Bijostruttura Asterbury (Università ta' Leeds, UK). Id-dejta nġabret fil-modalità tal-għadd b'ingrandiment ta' 130 k, u d-daqs tal-pixel ġie kalibrat għal 1.065 Å b'doża ta' 4.6 e-Å-2s-1. Il-film ġie rreġistrat fi 12-il sekonda u maqsum fi 48 parti. B'kollox, inġabru 3359 film, b'valuri ta' defocus bejn -1 u -3μm.
L-ipproċessar kollu tad-dejta jitwettaq fil-pipeline Relion 3.0 (42). Uża Motioncorr 2 (43) biex tikkoreġi l-moviment tar-raġġ permezz tal-ponderazzjoni tad-doża, u mbagħad uża CTFFIND 4.1 (44) biex tiddetermina l-parametru CTF (funzjoni tat-trasferiment tal-kuntrast). Fotomikrografi tipiċi wara dawn l-istadji inizjali tal-ipproċessar huma murija fil-Figura 2. S16. Il-mudell tal-għażla awtomatika huwa ġġenerat billi jintgħażlu manwalment madwar 250 pixel ta' 1000 partiċella f'qafas ta' 250 pixel u mingħajr klassifikazzjoni bidimensjonali (2D) ta' referenza, u b'hekk jiġu miċħuda dawk il-klassifikazzjonijiet li jissodisfaw il-kontaminazzjoni tal-kampjun jew li m'għandhom l-ebda karatteristika dixxernibbli. Imbagħad, l-għażla awtomatika twettqet fuq il-mikrofotografiji kollha, u l-RC-LH114-W kellu 849,359 partiċella, u l-kumpless RC-LH116 kellu 476,547 partiċella. Il-partiċelli kollha magħżula għaddew minn żewġ rawnds ta' klassifikazzjoni 2D mhux ta' referenza, u wara kull ġirja, il-partiċelli li jilħqu ż-żona tal-karbonju, kontaminazzjoni tal-kampjun, l-ebda karatteristika ovvja jew partiċelli li jikkoinċidu ħafna jiġu miċħuda, u dan jirriżulta f'772,033 (90.9%) u 359,678 (75.5%). Il-partiċelli jintużaw għall-klassifikazzjoni 3D ta' RC-LH114-W u RC-LH116 rispettivament. Il-mudell ta' referenza 3D inizjali ġie ġġenerat bl-użu tal-metodu ta' dixxendenza tal-gradjent stokastiku. Bl-użu tal-mudell inizjali bħala referenza, il-partiċelli magħżula huma kklassifikati f'erba' kategoriji fit-3D. Bl-użu tal-mudell f'din il-kategorija bħala referenza, wettaq raffinar 3D fuq il-partiċelli fl-akbar kategorija, imbagħad uża l-filtru low-pass inizjali ta' 15Å biex tkopri ż-żona tas-solvent, żid 6 pixels ta' truf rotob, u pproċessa l-pixels wara biex tikkoreġi l-funzjoni ta' trasferiment tal-Modulazzjoni tal-quċċata Gatan K2 tad-ditekter ta' fuq. Għad-dataset RC-LH114-W, dan il-mudell inizjali ġie modifikat billi tneħħiet id-densità qawwija fit-truf tal-maskra (skonnettjata mid-densità kumplessa tal-qalba f'UCSF Chimera). Il-mudelli li jirriżultaw (ir-riżoluzzjonijiet ta' RC-LH114-W u RC-LH116 huma 3.91 u 4.16 Å, rispettivament) jintużaw bħala referenza għat-tieni rawnd ta' klassifikazzjoni 3D. Il-partiċelli użati huma miġbura fil-klassi 3D inizjali u ma fihomx korrelazzjoni qawwija mal-viċinat. Koinċidenza jew nuqqas ta' karatteristiċi strutturali ovvji. Wara t-tieni rawnd ta' klassifikazzjoni 3D, intgħażlet il-kategorija bl-ogħla riżoluzzjoni [Għal RC-LH114-W, kategorija waħda hija 377,703 partiċella (44.5%), għal RC-LH116, hemm żewġ kategoriji, li jammontaw għal 260,752 partiċella (54.7%), Fejn huma l-istess biss meta allinjati wara r-rotazzjoni inizjali b'differenza żgħira]. Il-partiċelli magħżula jiġu estratti mill-ġdid f'kaxxa ta' 400 pixel u raffinati permezz ta' raffinar 3D. Il-maskra tas-solvent hija ġġenerata bl-użu tal-filtru low-pass inizjali ta' 15Å, espansjoni tal-mappa ta' 3 pixels u maskra ratba ta' 3 pixels. Bl-użu tar-raffinar tas-CTF għal kull partiċella, il-korrezzjoni tal-moviment għal kull partiċella u t-tieni rawnd ta' raffinar tas-CTF għal kull partiċella, ir-raffinar 3D, il-masking tas-solvent u l-ipproċessar ta' wara jitwettqu wara kull pass biex jiġi raffinat aktar in-nisġa li tirriżulta. Bl-użu tal-valur limitu tal-FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) ta' 0.143, ir-riżoluzzjonijiet tal-mudelli finali ta' RC-LH114-W u RC-LH116 huma 2.65 u 2.80Å, rispettivament. Il-kurva tal-FSC tal-mudell finali hija murija fil-Figura 2. S17.
Is-sekwenzi kollha tal-proteini huma mniżżla minn UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) intuża biex jinbena mudell ta' omoloġija ta' RC, li fih is-sekwenzi tal-proteini ta' RC-L, RC-M u RC-H u l-istruttura kristallina ta' Rba. sphaeroides RC intuża bħala mudell (PDB ID: 5LSE) (46). Uża l-għodda “fit map” f’UCSF Chimera biex twaħħal il-mudell iġġenerat mal-mappa (47), ittejjeb l-istruttura tal-proteina, u żid il-kofattur [4×BChl a (isem tar-residwu tal-librerija tal-monomeri = BCL), 2×BPh a (BPH), tip wieħed jew tnejn ta’ UQ10 (U10), ħadid mhux eme wieħed (Fe) u 3,4-diidroeżakarbonilkolina waħda (QAK)] uża Coot (48) biex iżżid. Peress li QAK mhuwiex disponibbli fil-librerija tal-monomeri, ġie parametrizzat bl-użu tal-għodda eLBOW f’PHENIX (49).
Imbagħad, inbniet is-subunità LH1. Inizjalment, l-għodda tal-kostruzzjoni awtomatika f'PHENIX (49) intużat biex tinbena awtomatikament parti mis-sekwenza LH1 bl-użu tal-mappa u s-sekwenzi tal-proteini LH1-α u LH1-β bħala input. Agħżel is-subunità LH1 l-aktar kompluta, estraiha u tgħabbiha f'Coot, żid manwalment is-sekwenza nieqsa fiha, u rfina manwalment l-istruttura kollha qabel ma żżid żewġ BCls a (BCL) u spirilloxanthin (CRT) [skont l-Rps rilevanti. Id-densità tal-kumpless LH1 u l-kontenut magħruf ta' karotenojdi. Speċi (17)]. Ikkopja s-subunità LH1 kompluta, u uża l-UCSF Chimera "Docking Map Tool" biex twaħħal fiż-żona mhux mudella biswit id-densità LH1, u mbagħad irfinaha f'Coot; irrepeti l-proċess sakemm is-subunitajiet LH1 kollha jkunu ġew immudellati. Għall-istruttura RC-LH114-W, billi tiġi estratta d-densità mhux allokata fil-Coot, il-proteina tiġi segmentata mill-komponenti mhux proteiniċi li jifdal fil-mappa USCF Chimera u l-għodda Autobuild tintuża biex tistabbilixxi l-mudell inizjali, u l-Immudellar tas-subunitajiet li jifdal (proteina-W). F'PHENIX (49). Żid kwalunkwe sekwenza nieqsa mal-mudell li jirriżulta f'Coot (48), u mbagħad irfina manwalment is-subunità kollha. Id-densità mhux allokata li jifdal taqbel mal-kombinazzjoni ta' lipidi (ID tal-librerija tal-monomeri PDB ta' CDL = CDL, POPC = 6PL u POPG = PGT), deterġent β-DDM (LMT) u molekuli UQ10 (U10). Uża l-ottimizzazzjoni PHENIX (49) u l-ottimizzazzjoni manwali f'Coot (48) biex tipperfezzjona l-mudell inizjali komplut sakemm l-istatistika tal-mudell u l-kwalità viżwali tal-adattament ma jkunux jistgħu jittejbu aktar. Fl-aħħarnett, uża LocScale (50) biex ittejjeb il-mappa lokali, u mbagħad wettaq diversi ċikli oħra ta' mmudellar tad-densità mhux allokata u ottimizzazzjoni awtomatika u manwali.
Il-peptidi, il-kofattori u lipidi u kinoni oħra rispettivi mwaħħlin fid-densitajiet rispettivi tagħhom huma murija fil-Figuri 1 u 2. S18 sa S23. L-informazzjoni statistika tal-mudell finali hija murija fit-Tabella S1.
Sakemm ma jkunx speċifikat mod ieħor, l-ispettri tal-assorbiment UV/Vis/NIR inġabru fuq spettrofotometru Cary60 (Agilent, USA) f'intervalli ta' 1 nm minn 250 nm sa 1000 nm u ħin ta' integrazzjoni ta' 0.1s.
Iddilwixxi l-kampjun f'kuvette tal-kwarz b'passaġġ ta' 2 mm sa A880 ta' 1, u iġbor l-ispettru tal-assorbiment bejn 400 u 1000 nm. L-ispettri dikroiċi ċirkolari nġabru fuq spettropolarimetru Jasco 810 (Jasco, il-Ġappun) f'intervalli ta' 1 nm bejn 400 nm u 950 nm b'rata ta' skennjar ta' 20 nm min-1.
Il-koeffiċjent tal-estinzjoni molari huwa determinat billi jiġi dilwit il-kumpless ċentrali għal A880 ta' madwar 50. Iddilwixxi l-volum ta' 10μl f'990μl ta' buffer tal-irbit jew metanol, u iġbor l-ispettru tal-assorbiment immedjatament biex timminimizza d-degradazzjoni tal-BChl. Il-kontenut ta' BChl ta' kull kampjun tal-metanol ġie kkalkulat bil-koeffiċjent tal-estinzjoni f'771 nm ta' 54.8 mM-1 cm-1, u l-koeffiċjent tal-estinzjoni ġie determinat (51). Aqsam il-konċentrazzjoni mkejla tal-BChl bi 32 (RC-LH114-W) jew 36 (RC-LH116) biex tiddetermina l-konċentrazzjoni tal-kumpless ċentrali, li mbagħad tintuża biex tiddetermina l-ispettru tal-assorbiment tal-istess kampjun miġbur fil-buffer parallel. Ittieħdu tliet kejl ripetuti għal kull kampjun, u l-assorbenza medja tal-massimu Qy tal-BChl intużat għall-kalkolu. Il-koeffiċjent ta' estinzjoni ta' RC-LH114-W imkejjel f'878 nm huwa 3280±140 mM-1 cm-1, filwaqt li l-koeffiċjent ta' estinzjoni ta' RC-LH116 imkejjel f'880 nm huwa 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 ġie kwantifikat skont il-metodu f'(52). Fil-qosor, l-HPLC b'fażi inversa (RP-HPLC) twettqet bl-użu tas-sistema Agilent 1200 HPLC. Dewweb madwar 0.02 nmol ta' RC-LH116 jew RC-LH114-W f'50μl ta' 50:50 metanol:kloroform li fih 0.02% (w/v) klorur ferriku, u injetta l-Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm Dewweb minn qabel f'1 ml-1 min-1 f'40°C f'solvent HPLC (80:20 metanol:2-propanol) fuq kolonna ta' ×25 cm. Wettaq eluzzjoni iżokratika f'solvent HPLC biex timmonitorja l-assorbenza f'275 nm (UQ10), 450 nm (karotenojdi) u 780 nm (BChl) għal siegħa. Il-quċċata fil-kromatogramma ta' 275 nm fil-25.5 minuti ġiet integrata, li ma kien fiha l-ebda kompost ieħor li jista' jiġi skopert. Iż-żona integrata tintuża biex tikkalkula l-ammont molari ta' UQ10 estratt b'referenza għall-kurva tal-kalibrazzjoni kkalkulata mill-injezzjoni ta' standards puri minn 0 sa 5.8 nmol (Figura S14). Kull kampjun ġie analizzat fi tliet repliki, u l-iżball irrappurtat jikkorrispondi għall-SD tal-medja.
Soluzzjoni li fiha l-kumpless RC-LH1 b'assorbiment massimu ta' Qy ta' 0.1 ġiet ippreparata bi 30 μM ċitokromu c2 tal-qalb taż-żiemel imnaqqas (Merck, UK) u 0 sa 50 μMUQ2 (Merck, UK). Tliet kampjuni ta' 1 ml ġew ippreparati f'kull konċentrazzjoni ta' UQ2 u inkubati matul il-lejl fid-dlam f'4°C biex jiġi żgurat adattament sħiħ għad-dlam qabel il-kejl. Is-soluzzjoni ġiet mgħobbija fi spettrofotometru modulari OLIS RSM1000 mgħammar bi fjamma ta' 300 nm/gradilja ta' 500 linja, dħul ta' 1.24 mm, nofs ta' 0.12 mm u xquq tal-ħruġ ta' 0.6 mm. Filtru twil ta' 600 nm jitqiegħed fid-daħla tat-tubu tal-foto tal-kampjun u t-tubu tal-fotomoltiplikatur ta' referenza biex jiġi eskluż id-dawl ta' eċċitazzjoni. L-assorbenza ġiet immonitorjata f'550 nm b'ħin ta' integrazzjoni ta' 0.15 s. Id-dawl ta' eċċitazzjoni jiġi emess mill-LED (Light Emitting Diode) M880F2 ta' 880 nm (Thorlabs Ltd., UK) permezz ta' kejbil tal-fibra ottika b'intensità ta' 90% permezz ta' kontrollur DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) u jiġi emess lis-sors tad-dawl f'angolu ta' 90°. Ir-raġġ tal-kejl huwa oppost għall-mera biex jirritorna kwalunkwe dawl li inizjalment ma ġiex assorbit mill-kampjun. Immonitorja l-assorbenza 10 s qabel l-illuminanza ta' 50 s. Imbagħad l-assorbenza ġiet immonitorjata aktar għal 60 s fid-dlam biex jiġi vvalutat sa liema punt il-quinolol inaqqas spontanjament iċ-ċitokromu c23+ (ara l-Figura S8 għal dejta mhux ipproċessata).
Id-dejta ġiet ipproċessata billi ġiet imwaħħla rata inizjali lineari fi żmien 0.5 sa 10 s (skont il-konċentrazzjoni tal-UQ2) u ttieħdet il-medja tar-rati tat-tliet kampjuni f'kull konċentrazzjoni tal-UQ2. Il-konċentrazzjoni RC-LH1 ikkalkulata mill-koeffiċjent tal-estinzjoni rispettiv intużat biex tikkonverti r-rata fl-effiċjenza katalitika, ipplottjata f'Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), u mwaħħla mal-mudell Michaelis-Menten biex tiddetermina l-valuri apparenti ta' Km u Kcat.
Għal kejl ta' assorbiment temporanju, il-kampjun RC-LH1 ġie dilwit għal ~2μM f'buffer IMAC li fih 50 mM sodium askorbate (Merck, USA) u 0.4 mM Terbutin (Merck, USA). L-aċidu askorbiku jintuża bħala donatur ta' elettroni sagrifiċjali, u t-tert-butaclofen jintuża bħala inibitur QB biex jiżgura li d-donatur RC ewlieni jibqa' mnaqqas (jiġifieri, mhux fotoossidat) matul il-proċess tal-kejl. Madwar 3 ml ta' kampjun jiżdiedu ma' ċellula rotanti apposta (madwar 0.1 m fid-dijametru, 350 RPM) b'tul ta' passaġġ ottiku ta' 2 mm biex jiżgura li l-kampjun fil-passaġġ tal-lejżer ikollu biżżejjed ħin għall-adattament għad-dlam bejn il-pulsijiet ta' eċċitazzjoni. Uża pulsijiet tal-lejżer ta' ~100-fs biex tamplifika s-sistema tal-lejżer Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) biex teċita l-kampjun f'880 nm b'rata ta' ripetizzjoni ta' 1 kHz (20 nJ għal NIR jew 100 nJ għal Vis). Qabel ma tiġbor id-dejta, esponi l-kampjun għal dawl ta' eċċitazzjoni għal madwar 30 minuta. L-esponiment se tikkawża inattivazzjoni tal-QA (possibilment tnaqqas il-QA darba jew darbtejn). Iżda jekk jogħġbok innota li dan il-proċess huwa riversibbli għaliex wara perjodu twil ta' adattament fid-dlam, RC bil-mod jerġa' lura għall-attività tal-QA. Intuża spettrometru Helios (Ultrafast Systems, USA) biex ikejjel l-ispettri tranżitorji b'ħin ta' dewmien ta' -10 sa 7000 ps. Uża s-softwer Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) biex tneħħi l-grupp tas-settijiet tad-dejta, imbagħad għaqqadhom u standardizzahom. Uża l-pakkett tas-softwer CarpetView (Light Conversion Ltd., Litwanja) biex tuża s-sett tad-dejta kkombinat biex tikseb spettri differenzjali relatati mat-tħassir, jew uża funzjoni li tikkonvolvi esponenti multipli mar-rispons tal-istrument biex taqbel mal-evoluzzjoni spettrali ta' wavelength waħda f'Origin (OriginLab, USA).
Kif imsemmi hawn fuq (53), tħejja film fotosintetiku li fih kumpless LH1 li ma fihx kemm antenna RC kif ukoll antenna periferali LH2. Il-membrana ġiet dilwita f'20 mM tris (pH 8.0) u mbagħad tpoġġiet f'kuvette tal-kwarz b'passaġġ ottiku ta' 2 mm. Puls tal-lejżer ta' 30nJ intuża biex jeċita l-kampjun f'540 nm b'ħin ta' dewmien ta' -10 sa 7000 ps. Ipproċessa s-sett tad-dejta kif deskritt għall-kampjun Rps.pal.
Il-membrana ġiet imfarrka permezz ta' ċentrifugazzjoni b'150,000 RCF għal sagħtejn f'4°C, u mbagħad l-assorbenza tagħha f'880 nm ġiet sospiża mill-ġdid f'20 mM tris-HCl (pH 8.0) u 200 mM NaCl. Dewweb il-membrana billi tħawwad bil-mod f'2% (w/v) β-DDM għal siegħa fid-dlam f'4°C. Il-kampjun ġie dilwit f'100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) għal konċentrazzjoni ta' proteina ta' 2.5 mg ml-1 (analiżi Bio-Rad). Sar aktar ipproċessar mill-metodu ppubblikat qabel (54), li beda bid-dilwizzjoni ta' 50 μg proteina f'total ta' 50 μl TEAB li fih 1% (w/v) sodium laurate (Merck, UK). Wara sonikazzjoni għal 60 sekonda, tnaqqset b'5 mM tris(2-karboxyethyl)phosphine (Merck, UK) f'37°C għal 30 minuta. Għal S-alkylation, inkuba l-kampjun b'10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) u żidu minn soluzzjoni stokk ta' 200 mM isopropanol għal 10 minuti f'temperatura tal-kamra. Id-diġestjoni proteolitika twettqet billi żidna 2 μg taħlita ta' trypsin/endoproteinase Lys-C (Promega UK) u inkubata f'37°C għal 3 sigħat. Is-surfactant tal-laurate ġie estratt billi żidna 50 μl ethyl acetate u 10 μl 10% (v/v) aċidu trifluoroaċetiku ta' grad LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) u tħawwad bil-vortex għal 60 sekonda. Is-separazzjoni tal-fażi ġiet promossa permezz ta' ċentrifugazzjoni f'15,700 RCF għal 5 minuti. Skont il-protokoll tal-manifattur, intużat kolonna spin C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) biex tiġi aspirata u mneħħija l-melħ bir-reqqa mill-fażi t'isfel li fiha l-peptid. Wara t-tnixxif permezz ta' ċentrifugazzjoni bil-vakwu, il-kampjun ġie maħlul f'0.5% TFA u 3% aċetonitrile, u 500 ng ġew analizzati permezz ta' kromatografija nanoflow RP akkoppjata ma' spettrometrija tal-massa bl-użu tal-parametri tas-sistema dettaljati qabel.
Uża MaxQuant v.1.5.3.30 (56) għall-identifikazzjoni u l-kwantifikazzjoni tal-proteini biex tfittex id-database tal-proteoma Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Id-dejta tal-proteomika tal-ispettrometrija tal-massa ġiet depożitata fil-ProteomeXchange Alliance permezz tar-repożitorju tas-sieħeb PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) taħt l-identifikatur tas-sett tad-dejta PXD020402.
Għall-analiżi permezz ta' RPLC akkoppjata ma' spettrometrija tal-massa ta' jonizzazzjoni bl-elettrosprej, il-kumpless RC-LH1 ġie ppreparat minn Rps tat-tip selvaġġ. Bl-użu tal-metodu ppubblikat qabel (16), il-konċentrazzjoni tal-proteina prodotta fiċ-ċelloli palustris kienet ta' 2 mg ml-1 f'20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl u 0.03% (w/v) β- (analiżi Bio-Rad)) DDM. Skont il-protokoll tal-manifattur, uża kit ta' purifikazzjoni 2D (GE Healthcare, USA) biex tiġbed 10 μg ta' proteina permezz tal-metodu ta' preċipitazzjoni, u dewweb il-preċipitat f'20 μl 60% (v/v) aċidu formiku (FA), 20% (v/v) Aċetonitrile u 20% (v/v) ilma. Ħames mikrolitri ġew analizzati permezz ta' RPLC (Dionex RSLC) akkoppjata ma' spettrometrija tal-massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Uża kolonna MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) għas-separazzjoni f'60°C u 100μlmin -1, b'gradjent ta' 85% (v / v) solvent A [0.1% (v / v) FA u 0.02% (V/v) soluzzjoni akwea TFA] għal 85%(v/v) solvent B [0.1%(v/v) FA u 0.02%(v/v) f'90%(v/v) aċetonitrile TFA]. Bl-użu ta' sors standard ta' jonizzazzjoni bl-elettrosprej u parametri awtomatiċi għal aktar minn 60 minuta, l-ispettrometru tal-massa jikseb 100 sa 2750 m/z (proporzjon massa-ċarġ). Bl-għajnuna tal-portal tar-riżorsi bijoinformatiċi ExPASy FindPept (https://web.expasy.org/findpept/), immappja l-ispettru tal-massa mas-subunitajiet tal-kumpless.
Iċ-ċelloli tkabbru għal 72 siegħa taħt 100 ml dawl NF-baxx (10μMm-2 s-1), medju (30μMm-2 s-1) jew għoli (300μMm-2 s-1). Mezz M22 (mezz M22 li fih l-ammonju sulfat jitħalla barra u s-sodium succinate jiġi sostitwit b'sodium acetate) fi flixkun b'tapp bil-kamin ta' 100 ml (23). F'ħames ċikli ta' 30 sekonda, żibeġ tal-ħġieġ ta' 0.1 mikron ġew imdaħħla biż-żibeġ fi proporzjon ta' volum ta' 1:1 biex jiġu liżati ċ-ċelloli u mkessħin fuq is-silġ għal 5 minuti. Il-materja li ma tinħallx, iċ-ċelloli mhux imkissra u ż-żibeġ tal-ħġieġ tneħħew permezz ta' ċentrifugazzjoni b'16,000 RCF għal 10 minuti f'mikroċentrifuga fuq il-bank. Il-membrana ġiet separata f'rotor Ti 70.1 b'100,000 RCF f'20 mM tris-HCl (pH 8.0) bi gradjent ta' sukrożju ta' 40/15% (w/w) għal 10 sigħat.
Kif deskritt fix-xogħol preċedenti tagħna, immunodetezzjoni tat-tikketta His fuq PufW (16). Fil-qosor, il-kumpless ċentrali purifikat (11.8 nM) jew il-membrana li fiha l-istess konċentrazzjoni ta' RC (determinata bl-ossidazzjoni billi tnaqqas l-ispettru tad-differenza mnaqqsa u tqabbel it-tagħbija fuq il-ġel imtebba') f'buffer tat-tagħbija 2x SDS (Merck, UK) dilwit darbtejn. Il-proteini ġew separati fuq replika ta' ġel NuPage ta' 12% bis-tris (Thermo Fisher Scientific, UK). Ġel ġie mtebba' b'Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) biex titgħabba u tiġi viżwalizzata s-subunità RC-L. Il-proteina fuq it-tieni ġel ġiet trasferita għal membrana tal-polivinilidene fluoride attivata bil-metanol (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, UK) għal immunoassay. Il-membrana PVDF ġiet imblukkata f'50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 u 5% (w/v) trab tal-ħalib xkumat, u mbagħad inkubata mal-antikorp primarju anti-His (f'Dilute the antibody buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl u 0.05% (v/v) Tween-20] f'1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) għal 4 sigħat. Wara ħasil 3 darbiet għal 5 minuti f'buffer tal-antikorpi, il-membrana ngħaqdet ma' antikorp sekondarju kontra l-ġrieden tal-horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich, UK) (dilwit 1:10,000 f'buffer tal-antikorpi). Inkuba biex tippermetti d-detezzjoni (5 minuti wara 3 ħasliet f'buffer tal-antikorpi) bl-użu tas-sottostrat tal-kemiluminexxenza WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, l-Italja) u l-Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Billi tfassal id-distribuzzjoni tal-intensità ta' kull ġel imtebba' jew korsija ta' immunoassay, tintegra l-erja taħt il-quċċata u tikkalkula l-proporzjon tal-intensità ta' RC-L (ġel imtebba') u Protein-W (immunoassay), f'ImageJ (57) Ipproċessa l-immaġni. Dawn il-proporzjonijiet ġew konvertiti għal proporzjonijiet molari billi assumiet li l-proporzjon ta' RC-L għal proteina-W fil-kampjun pur RC-LH114-W kien 1:1 u nnormalizzat is-sett tad-dejta kollu kif xieraq.
Għal materjali supplimentari għal dan l-artiklu, jekk jogħġbok ara http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Dan huwa artiklu b'aċċess miftuħ imqassam skont it-termini tal-Liċenzja ta' Attribuzzjoni Creative Commons. L-artiklu jippermetti użu, distribuzzjoni u riproduzzjoni mingħajr restrizzjonijiet fi kwalunkwe mezz bil-kundizzjoni li x-xogħol oriġinali jiġi ċċitat kif suppost.
Nota: Nitolbuk biss li tipprovdi l-indirizz elettroniku tiegħek sabiex il-persuna li tirrakkomanda lill-paġna tkun taf li tridha tara l-email u li mhijiex spam. Mhux se naqbdu l-ebda indirizz elettroniku.
Din il-mistoqsija tintuża biex tittestja jekk intix viżitatur u tipprevjeni s-sottomissjoni awtomatika ta' spam.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
L-istruttura b'riżoluzzjoni għolja tal-kumpless tan-nassa tad-dawl 1 fiċ-ċentru tar-reazzjoni tipprovdi għarfien ġdid dwar id-dinamika tal-kinone.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
L-istruttura b'riżoluzzjoni għolja tal-kumpless tan-nassa tad-dawl 1 fiċ-ċentru tar-reazzjoni tipprovdi għarfien ġdid dwar id-dinamika tal-kinone.
©2021 Assoċjazzjoni Amerikana għall-Avvanz tax-Xjenza. id-drittijiet kollha riżervati. AAAS hija sieħba ta' HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef u COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.