Preżenti *Indirizz attwali: Cologne 50931, il-Ġermanja, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-Related Diseases (CECAD).
In-newrodeġenerazzjoni tal-mard mitokondrijali hija kkunsidrata irriversibbli għaliex il-plastiċità metabolika tan-newroni hija limitata, iżda l-effett tad-disfunzjoni mitokondrijali fuq l-awtonomija taċ-ċelluli tal-metaboliżmu newronali fil-ġisem mhux mifhum sew. Hawnhekk, nintroduċu l-proteoma speċifika għaċ-ċelluli tan-newroni ta' Purkinje b'defiċjenza progressiva ta' OXPHOS ikkawżata minn dinamika ta' fużjoni mitokondrijali mfixkla. Sibna li d-disfunzjoni mitokondrijali wasslet għal bidla profonda fil-qasam tal-proteomika, li fl-aħħar mill-aħħar wasslet għall-attivazzjoni sekwenzjali ta' programmi metaboliċi preċiżi qabel il-mewt taċ-ċelluli. B'mod mhux mistenni, iddeterminajna l-induzzjoni ovvja ta' pyruvate carboxylase (PCx) u enzimi oħra kontra t-tixjiħ li jissupplimentaw l-intermedji taċ-ċiklu TCA. L-inibizzjoni ta' PCx aggravat l-istress ossidattiv u n-newrodeġenerazzjoni, li jindika li l-aterosklerożi għandha effett protettiv fin-newroni li m'għandhomx OXPHOS. Ir-restawr tal-fużjoni mitokondrijali f'newroni deġenerati terminalment ireġġa' lura kompletament dawn il-karatteristiċi metaboliċi, u b'hekk jipprevjeni l-mewt taċ-ċelluli. Is-sejbiet tagħna jidentifikaw mogħdijiet li qabel ma kinux magħrufa li jikkonferixxu reżiljenza għad-disfunzjoni mitokondrijali u juru li n-newrodeġenerazzjoni tista' tiġi rriversjata anke fl-istadji tard tal-marda.
Ir-rwol ċentrali tal-mitokondrija fiż-żamma tal-metaboliżmu tal-enerġija newronali huwa enfasizzat mis-sintomi newroloġiċi estensivi assoċjati mal-mard mitokondrijali tal-bniedem. Ħafna minn dawn il-mard huma kkawżati minn mutazzjonijiet tal-ġeni li jirregolaw l-espressjoni tal-ġeni mitokondrijali (1, 2) jew il-qerda tal-ġeni relatata mad-dinamika mitokondrijali, li indirettament jaffettwaw l-istabbiltà tad-DNA mitokondrijali (mtDNA) (3, 4). Xogħol f'mudelli tal-annimali wera li b'reazzjoni għal disfunzjoni mitokondrijali fit-tessuti tal-madwar, jistgħu jiġu attivati ​​mogħdijiet metaboliċi konservattivi (5-7), li jipprovdi informazzjoni importanti għal fehim fil-fond tal-patoġenesi ta' dawn il-mard kumplessi. B'kuntrast qawwi, il-fehim tagħna tal-bidliet metaboliċi ta' tipi speċifiċi ta' ċelluli kkawżati mill-falliment ġenerali tal-produzzjoni ta' adenosine triphosphate (ATP) mitokondrijali tal-moħħ huwa fundamentali (8), u jenfasizza l-ħtieġa li jiġu identifikati miri terapewtiċi li jistgħu jintużaw biex jipprevjenu jew jipprevjenu l-mard. Prevenzjoni tan-newrodeġenerazzjoni (9). In-nuqqas ta' informazzjoni huwa dovut għall-fatt li ċ-ċelluli tan-nervituri huma ġeneralment ikkunsidrati li għandhom flessibilità metabolika limitata ħafna meta mqabbla mat-tipi ta' ċelluli tat-tessuti tal-madwar (10). Minħabba li dawn iċ-ċelloli għandhom rwol ċentrali fil-koordinazzjoni tal-provvista ta' metaboliti lin-newroni biex jippromwovu t-trażmissjoni sinaptika u jirrispondu għal kundizzjonijiet ta' korriment u mard, il-kapaċità li l-metaboliżmu taċ-ċelloli jiġi adattat għall-kundizzjonijiet ta' sfida tat-tessut tal-moħħ hija kważi limitata għaċ-ċelloli gliali (11-14). Barra minn hekk, l-eteroġeneità ċellulari inerenti tat-tessut tal-moħħ tfixkel ħafna l-istudju tal-bidliet metaboliċi li jseħħu f'sottogruppi newronali speċifiċi. Bħala riżultat, ftit li xejn huwa magħruf dwar il-konsegwenzi ċellulari u metaboliċi eżatti tad-disfunzjoni mitokondrijali fin-newroni.
Sabiex nifhmu l-konsegwenzi metaboliċi tad-disfunzjoni mitokondrijali, iżolajna n-newroni ta' Purkinje (PNs) fi stadji differenti ta' newrodeġenerazzjoni kkawżata mill-qerda tal-fużjoni tal-membrana ta' barra mitokondrijali (Mfn2). Għalkemm il-mutazzjonijiet ta' Mfn2 fil-bnedmin huma assoċjati ma' forma ta' newropatija sensorja motorja ereditarja magħrufa bħala Charcot-Marie-Tooth tip 2A (15), il-qerda kondizzjonali ta' Mfn2 fil-ġrieden hija metodu ta' disfunzjoni ta' induzzjoni ta' ossidazzjoni u fosforilazzjoni (OXPHOS) rikonoxxut sew. Id-diversi sottotipi newronali (16-19) u l-fenotip newrodeġenerattiv li jirriżulta huma akkumpanjati minn sintomi newroloġiċi progressivi, bħal disturbi fil-moviment (18, 19) jew atassija ċerebellari (16). Bl-użu ta' taħlita ta' proteomika kwantitattiva mingħajr tiketti (LFQ), metabolomika, immaġini, u metodi viroloġiċi, nuru li n-newrodeġenerazzjoni progressiva tinduċi b'mod qawwi l-piruvat karbossilażi (PCx) u fatturi oħra involuti fl-arterjosklerożi tal-PNs in vivo. L-espressjoni tal-enzimi. Biex nivverifikaw ir-rilevanza ta' din is-sejba, aħna speċifikament naqqasna l-espressjoni ta' PCx f'PNs defiċjenti f'Mfn2, u sibna li din l-operazzjoni aggravat l-istress ossidattiv u aċċellerat in-newrodeġenerazzjoni, u b'hekk uriet li l-ażoospermja tikkonferixxi mewt taċ-ċelluli. Adattabilità metabolika. Espressjoni severa ta' MFN2 tista' ssalva kompletament id-deġenerazzjoni terminali ta' PN b'defiċjenza severa ta' OXPHOS, konsum massiv ta' DNA mitokondrijali, u netwerk mitokondrijali apparentement imkisser, li jenfasizza aktar li din il-forma ta' newrodeġenerazzjoni tista' saħansitra tirkupra fl-istadju avvanzat tal-marda qabel il-mewt taċ-ċelluli.
Sabiex nivviżwalizzaw il-mitokondrija fil-PNs knockout ta' Mfn2, użajna razza ta' ġrieden li tippermetti lill-mitokondrija dipendenti fuq Cre li jimmiraw lejn l-espressjoni ta' Cre tal-proteina fluworexxenti safra (YFP) (mtYFP) (20) u vverifikajna l-morfoloġija mitokondrijali in vivo. Sibna li l-qerda tal-ġene Mfn2 fil-PNs twassal għad-diviżjoni gradwali tan-netwerk mitokondrijali (Figura S1A), u l-aktar bidla bikrija nstabet fl-età ta' 3 ġimgħat. B'kuntrast, id-deġenerazzjoni sostanzjali tas-saff taċ-ċelluli PN, kif evidenzjat mit-telf tal-immunokolorazzjoni ta' Calbindin, ma bdietx qabel l-età ta' 12-il ġimgħa (Figura 1, A u B). Id-diskrepanza fil-ħin bejn l-aktar bidliet bikrija fil-morfoloġija mitokondrijali u l-bidu viżibbli tal-mewt newronali wasslitna biex ninvestigaw il-bidliet metaboliċi kkawżati minn disfunzjoni mitokondrijali qabel il-mewt taċ-ċelluli. Żviluppajna strateġija bbażata fuq l-issortjar taċ-ċelluli attivati ​​bil-fluworexxenza (FACS) biex niżolaw PN li jesprimu YFP (YFP+) (Figura 1C), u fil-ġrieden ta' kontroll (Mfn2+ / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), minn hawn 'il quddiem imsejħa CTRL (Figura S1B). L-ottimizzazzjoni tal-istrateġija tal-gating ibbażata fuq l-intensità relattiva tas-sinjal YFP tippermettilna nippurifikaw il-ġisem YFP+ (YFPhigh) tal-PNs minn dawk mhux PNs (YFPneg) (Figura S1B) jew frammenti putattivi ta' assoni/dendritiċi fluworexxenti (YFPlow; Figura S1D, xellug), ikkonfermati b'mikroskopju konfokali (Figura S1D, lemin). Sabiex nivverifikaw l-identità tal-popolazzjoni kklassifikata, wettaqna proteomika LFQ u mbagħad analiżi tal-komponenti prinċipali, u sibna li hemm separazzjoni ċara bejn iċ-ċelluli YFPhigh u YFPneg (Figura S1C). Iċ-ċelloli YFPhigh urew arrikkiment nett ta' markaturi PNs magħrufa (jiġifieri Calb1, Pcp2, Grid2 u Itpr3) (21, 22), iżda l-ebda arrikkiment ta' proteini espressi b'mod komuni fin-newroni jew tipi oħra ta' ċelloli (Figura 1D)). Paragun bejn kampjuni f'ċelloli YFPhigh klassifikati miġbura f'esperimenti indipendenti wera koeffiċjent ta' korrelazzjoni > 0.9, li juri riproduċibbiltà tajba bejn repliki bijoloġiċi (Figura S1E). Fil-qosor, din id-dejta vvalidat il-pjan tagħna għal iżolament akut u speċifiku ta' PN fattibbli. Minħabba li s-sistema tas-sewwieq L7-cre użata tinduċi rikombinazzjoni tal-mużajk fl-ewwel ġimgħa wara l-kunsinna (23), bdejna naqtgħu l-ġrieden minn CTRL u kondizzjonali (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Niġbru n-newroni. Wara li titlesta r-rikombinazzjoni, tissejjaħ Mfn2cKO fl-età ta' 4 ġimgħat. Bħala l-punt finali, għażilna 8 ġimgħat meta s-saff PN kien intatt minkejja l-frammentazzjoni mitokondrijali ovvja (Figura 1B u Figura S1A). B'kollox, ikkwantifikajna total ta' 3013 proteina, li minnhom madwar 22% kienu bbażati fuq annotazzjonijiet ta' MitoCarta 2.0 ibbażati fuq il-proteoma mitokondrijali bħala mitokondrija (Figura 1E) (Figura 1E) (24). L-analiżi differenzjali tal-espressjoni tal-ġeni mwettqa fil-ġimgħa 8 uriet li 10.5% biss tal-proteini kollha kellhom bidliet sinifikanti (Figura 1F u Figura S1F), li minnhom 195 proteina kienu regolati 'l isfel u 120 proteina kienu regolati 'l fuq (Figura 1F). Ta' min jinnota li l-"analiżi innovattiva tal-mogħdijiet" ta' dan is-sett ta' dejta turi li l-ġeni espressi b'mod differenzjali prinċipalment jappartjenu għal sett ristrett ta' mogħdijiet metaboliċi speċifiċi (Figura 1G). Interessanti, għalkemm ir-regolazzjoni 'l isfel tal-mogħdijiet relatati ma' OXPHOS u s-sinjalar tal-kalċju tikkonferma l-induzzjoni ta' disfunzjoni mitokondrijali f'PNs defiċjenti fil-fużjoni, kategoriji oħra li prinċipalment jinvolvu l-metaboliżmu tal-aċidi amminiċi huma regolati 'l fuq b'mod sinifikanti, li huwa konformi mal-metaboliżmu li jseħħ f'PNs mitokondrijali. Ir-rewiring huwa konsistenti.
(A) Ritratti konfokali rappreżentattivi ta' sezzjonijiet ċerebellari ta' ġrieden CTRL u Mfn2cKO li juru telf progressiv ta' PNs (calbindin, griż); in-nuklei ġew kontro-miżbugħin b'DAPI. (B) Kwantifikazzjoni ta' (A) (analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda, ***P<0.001; n = 4 sa 6 ċrieki minn tliet ġrieden). (C) Fluss tax-xogħol sperimentali. (D) Distribuzzjoni tal-mappa tas-sħana ta' markaturi speċifiċi għal Purkinje (fuq) u tipi oħra ta' ċelluli (fin-nofs). (E) Dijagramma ta' Venn li turi n-numru ta' proteini mitokondrijali identifikati fil-PN ikklassifikat. (F) Plott tal-vulkan ta' proteini espressi b'mod differenzjali fin-newroni Mfn2cKO fi 8 ġimgħat (valur limitu ta' sinifikat ta' 1.3). (G) L-analiżi tal-mogħdija tal-kreattività turi l-ħames mogħdijiet l-aktar importanti ta' up-regulation (aħmar) u down-regulation (blu) fil-PN Mfn2cKO ikklassifikat bħala 8 ġimgħat. Il-livell medju ta' espressjoni ta' kull proteina skoperta huwa muri. Mappa tas-sħana fuq skala griża: valur P aġġustat. ns, mhux importanti.
Id-dejta proteomika wriet li l-espressjoni tal-proteini tal-kumplessi I, III, u IV naqset gradwalment. Il-kumplessi I, III, u IV kollha kien fihom subunitajiet essenzjali kkodifikati mill-mtDNA, filwaqt li l-kumpless II, li kien ikkodifikat biss nukleari, bażikament ma kienx affettwat (Figura 2A u Figura S2A). . Konsistenti mar-riżultati proteomiċi, l-immunoistokimika tas-sezzjonijiet tat-tessut ċerebellari wriet li l-livell tas-subunità MTCO1 (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1) tal-kumpless IV fil-PN naqas gradwalment (Figura 2B). Is-subunità Mtatp8 kkodifikata mill-mtDNA tnaqqset b'mod sinifikanti (Figura S2A), filwaqt li l-livell fi stat fiss tas-subunità ATP synthase kkodifikata nukleari baqa' l-istess, li huwa konsistenti mal-kumpless F1 tas-subassemblaġġ tal-ATP synthase stabbli magħruf meta l-espressjoni tal-mtDNA tkun stabbli. Il-formazzjoni hija konsistenti. Interrupt (7). L-evalwazzjoni tal-livell tal-mtDNA fil-PNs Mfn2cKO magħżula permezz ta' reazzjoni katina tal-polimerażi f'ħin reali (qPCR) ikkonfermat it-tnaqqis gradwali fin-numru ta' kopji tal-mtDNA. Meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll, fl-età ta' 8 ġimgħat, madwar 20% biss tal-livell tal-mtDNA nżamm (Figura 2C). Konsistenti ma' dawn ir-riżultati, it-tebgħa bil-mikroskopija konfokali tal-PNs Mfn2cKO intużat biex tiskopri d-DNA, li turi l-konsum dipendenti fuq il-ħin tan-nukleotidi mitokondrijali (Figura 2D). Sibna li xi kandidati biss involuti fid-degradazzjoni tal-proteini mitokondrijali u r-rispons għall-istress kienu regolati 'l fuq, inklużi Lonp1, Afg3l2 u Clpx, u l-fatturi ta' assemblaġġ kumplessi OXPHOS. Ma nstabu l-ebda bidliet sinifikanti fil-livelli ta' proteini involuti fl-apoptożi (Figura S2B). Bl-istess mod, sibna li l-kanali tal-mitokondrija u tar-retikulu endoplasmiku involuti fit-trasport tal-kalċju għandhom biss bidliet żgħar (Figura S2C). Barra minn hekk, l-evalwazzjoni tal-proteini relatati mal-awtofaġija ma sabet l-ebda bidla sinifikanti, li hija konsistenti mal-induzzjoni viżibbli ta' awtofagosomi osservata in vivo permezz ta' immunoistokimika u mikroskopija elettronika (Figura S3). Madankollu, id-disfunzjoni progressiva tal-OXPHOS fil-PNs hija akkumpanjata minn bidliet mitokondrijali ultrastrutturali ovvji. Raggruppamenti mitokondrijali jistgħu jidhru fil-korpi taċ-ċelluli u s-siġar dendritiċi tal-PNs Mfn2cKO ta' 5 u 8 ġimgħat, u l-istruttura tal-membrana ta' ġewwa għaddiet minn bidliet profondi (Figura S4, A u B). Konsistenti ma' dawn il-bidliet ultrastrutturali u tnaqqis sinifikanti fl-mtDNA, l-analiżi ta' flieli ċerebrali ċerebrali akuti bit-tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) uriet li l-potenzjal tal-membrana mitokondrijali fil-PNs Mfn2cKO kien imnaqqas b'mod sinifikanti (Figura S4C).
(A) Analiżi tal-kors taż-żmien tal-livell ta' espressjoni tal-kumpless OXPHOS. Ikkunsidra biss proteini b'P<0.05 fi 8 ġimgħat (ANOVA b'żewġ direzzjonijiet). Linja bit-tikek: L-ebda aġġustament meta mqabbel ma' CTRL. (B) Xellug: Eżempju ta' sezzjoni ċerebellari mmarkata b'antikorp anti-MTCO1 (skala bar, 20 μm). Iż-żona okkupata mill-korpi taċ-ċelluli ta' Purkinje hija mgħottija bl-isfar. Lemin: Kwantifikazzjoni tal-livelli ta' MTCO1 (analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda; n = 7 sa 20 ċellula analizzati minn tliet ġrieden). (C) Analiżi qPCR tan-numru ta' kopji tal-mtDNA fil-PN magħżul (analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda; n = 3 sa 7 ġrieden). (D) Xellug: Eżempju ta' porzjon ċerebellari mmarkat b'antikorp anti-DNA (skala bar, 20 μm). Iż-żona okkupata mill-korpi taċ-ċelluli ta' Purkinje hija mgħottija bl-isfar. Lemin: Kwantifikazzjoni tal-leżjonijiet tal-mtDNA (analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda; n = 5 sa 9 ċelluli minn tliet ġrieden). (E) Eżempju ta' sezzjoni ċerebellari akuta li turi ċ-ċelloli mitoYFP + Purkinje (vleġġa) f'reġistrazzjoni ta' garża clamp taċ-ċelloli sħaħ. (F) Kwantifikazzjoni tal-kurva IV. (G) Reġistrazzjonijiet rappreżentattivi ta' injezzjoni ta' kurrent depolarizzanti fiċ-ċelloli CTRL u Mfn2cKO Purkinje. Traċċa ta' fuq: L-ewwel impuls li qanqal l-AP. Traċċa ta' isfel: Frekwenza massima tal-AP. (H) Kwantifikazzjoni ta' inputs spontanei postsinaptiċi (sPSPs). It-traċċa rappreżentattiva tar-reġistrazzjoni u l-proporzjon taż-żum tagħha huma murija f'(I). Analiżi f'direzzjoni waħda tal-varjanza analizzata n = 5 sa 20 ċellola minn tliet ġrieden. Id-dejta hija espressa bħala medja±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Traċċi rappreżentattivi ta' AP spontanju rreġistrati bl-użu tal-modalità perforata tal-garża clamp. Traċċa ta' fuq: Frekwenza massima tal-AP. Traċċa ta' isfel: zoom ta' AP wieħed. (K) Kwantifika l-frekwenza medja u massima tal-AP skont (J). Test Mann-Whitney; n = 5 ċelloli ġew analizzati minn erba' ġrieden. Id-dejta hija espressa bħala medja ± SEM; mhux importanti.
Ġiet skoperta ħsara ovvja fl-OXPHOS fl-Mfn2cKO PN ta' 8 ġimgħat, li tindika li l-funzjoni fiżjoloġika tan-newroni hija severament anormali. Għalhekk, analizzajna l-karatteristiċi elettriċi passivi tan-newroni defiċjenti fl-OXPHOS f'4 sa 5 ġimgħat u 7 sa 8 ġimgħat billi wettaqna reġistrazzjonijiet ta' garża morsa taċ-ċelluli sħaħ f'biċċiet ċerebellari akuti (Figura 2E). B'mod mhux mistenni, il-potenzjal medju tal-membrana mistrieħa u r-reżistenza tad-dħul tan-newroni Mfn2cKO kienu simili għall-kontroll, għalkemm kien hemm differenzi sottili bejn iċ-ċelluli (Tabella 1). Bl-istess mod, fl-età ta' 4 sa 5 ġimgħat, ma nstabet l-ebda bidla sinifikanti fir-relazzjoni kurrent-vultaġġ (kurva IV) (Figura 2F). Madankollu, l-ebda newron Mfn2cKO ta' 7 sa 8 ġimgħat ma baqa' ħaj mir-reġim IV (pass ta' iperpolarizzazzjoni), li jindika li hemm sensittività ċara għall-potenzjal ta' iperpolarizzazzjoni f'dan l-istadju tard. B'kuntrast, fin-newroni Mfn2cKO, il-kurrenti depolarizzanti li jikkawżaw skariki ta' potenzjal ta' azzjoni ripetittiva (AP) huma tollerati tajjeb, u dan jindika li x-xejriet ġenerali ta' skariku tagħhom mhumiex differenti b'mod sinifikanti minn dawk tan-newroni ta' kontroll ta' 8 ġimgħat (Tabella 1 u Figura 2G). Bl-istess mod, il-frekwenza u l-amplitudni tal-kurrenti postsinaptiċi spontanei (sPSCs) kienu komparabbli ma' dawk tal-grupp ta' kontroll, u l-frekwenza tal-avvenimenti żdiedet minn 4 ġimgħat għal 5 ġimgħat għal 7 ġimgħat għal 8 ġimgħat b'żieda simili (Figura 2, H u I). Il-perjodu ta' maturazzjoni sinaptika fil-PNs (25). Riżultati simili nkisbu wara irqajja' perforati tal-PNs. Din il-konfigurazzjoni tipprevjeni l-kumpens possibbli ta' difetti ċellulari tal-ATP, kif jista' jiġri fir-reġistrazzjoni tal-garża tal-morsa taċ-ċelluli sħaħ. B'mod partikolari, il-potenzjal tal-membrana ta' mistrieħ u l-frekwenza ta' sparar spontanju tan-newroni Mfn2cKO ma ġewx affettwati (Figura 2, J u K). Fil-qosor, dawn ir-riżultati jindikaw li l-PNs b'disfunzjoni ovvja ta' OXPHOS jistgħu jlaħħqu sew ma' mudelli ta' skarika ta' frekwenza għolja, u dan jindika li hemm mekkaniżmu ta' kumpens li jippermettilhom iżommu risponsi elettrofiżjoloġiċi kważi normali.
Id-dejta hija espressa bħala medja ± SEM (analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda, test ta' tqabbil multiplu ta' Holm-Sidak; *P<0.05). In-numru tal-unità huwa indikat permezz ta' parentesi.
Iddeċidejna li ninvestigaw jekk xi kategorija fid-dataset tal-proteomika (Figura 1G) tinkludix mogħdijiet li jistgħu jikkontrobattu defiċjenza severa ta' OXPHOS, u b'hekk nispjegaw għaliex PN affettwata tista' żżomm elettrofiżjoloġija kważi normali (Figura 2, E sa K). L-analiżi tal-proteomika wriet li l-enzimi involuti fil-kataboliżmu tal-aċidi amminiċi b'katina ramifikata (BCAA) kienu regolati 'l fuq b'mod sinifikanti (Figura 3A u Figura S5A), u l-prodott finali acetyl-CoA (CoA) jew succinyl CoA jistgħu jissupplimentaw it-tricarboxylates fiċ-ċiklu tal-Aċidu tal-arterjosklerożi (TCA). Sibna li l-kontenut ta' BCAA transaminase 1 (BCAT1) u BCAT2 it-tnejn żdied. Huma jikkatalizzaw l-ewwel pass tal-kataboliżmu tal-BCAA billi jiġġeneraw glutamate minn α-ketoglutarate (26). Is-subunitajiet kollha li jiffurmaw il-kumpless tal-keto acid dehydrogenase (BCKD) b'katina ramifikata huma regolati 'l fuq (il-kumpless jikkatalizza d-dekarbossilazzjoni sussegwenti u irriversibbli tal-iskeletru tal-karbonju BCAA li jirriżulta) (Figura 3A u Figura S5A). Madankollu, ma nstabu l-ebda bidliet ovvji fil-BCAA nnifisha fil-PN magħżula, li jistgħu jkunu dovuti għaż-żieda fl-assorbiment ċellulari ta' dawn l-aċidi amminiċi essenzjali jew għall-użu ta' sorsi oħra (glukożju jew aċidu lattiku) biex jissupplimentaw iċ-ċiklu TCA (Figura S5B). Il-PNs li m'għandhomx OXPHOS urew ukoll żieda fl-attivitajiet ta' dekompożizzjoni u transaminazzjoni tal-glutamina fl-età ta' 8 ġimgħat, li jistgħu jiġu riflessi mir-regolazzjoni 'l fuq tal-enzimi mitokondrijali glutaminase (GLS) u glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Figura 3, A u C). Ta' min jinnota li r-regolazzjoni 'l fuq tal-GLS hija limitata għall-isoforma glutaminase C imqaxxra (GLS-GAC) (il-bidla ta' Mfn2cKO/CTRL hija madwar 4.5 darbiet, P = 0.05), u r-regolazzjoni 'l fuq speċifika tagħha fit-tessuti tal-kanċer tista' tappoġġja l-bijoenerġija mitokondrijali. (27).
(A) Il-mappa tas-sħana turi l-bidla fil-livell tal-proteina għar-rotta speċifikata fi 8 ġimgħat. (B) Eżempju ta' porzjon ċerebellari mmarkat b'antikorp anti-PCx (skala bar, 20 μm). Il-vleġġa safra tipponta lejn il-ġisem taċ-ċellula ta' Purkinje. (C) Analiżi tal-espressjoni tal-proteina matul iż-żmien identifikata bħala kandidat importanti għall-aterosklerożi (test-t multiplu, *FDR <5%; n = 3-5 ġrieden). (D) Fuq: Dijagramma skematika li turi l-modi differenti ta' kif jidħol il-karbonju mmarkat li jinsab fit-traċċatur [1-13C]piruvat (jiġifieri, permezz ta' PDH jew rotta trans-arterjali). Isfel: Iċ-ċart tal-vjolin turi l-perċentwal ta' karbonju mmarkat b'mod wieħed (M1) konvertit f'aċidu aspartiku, aċidu ċitriku u aċidu maliku wara li ġew immarkati porzjonijiet ċerebellari akuti b'[1-13C]piruvat (test-t imqabbad; ** P <0.01). (E) Analiżi komprensiva tal-istorja taż-żmien tal-mogħdija indikata. Ikkunsidra biss proteini b'P<0.05 fi 8 ġimgħat. Linja mqattgħa: l-ebda valur ta' aġġustament (analiżi tal-varjanza f'żewġ direzzjonijiet; * P <0.05; *** P <0.001). Id-dejta hija espressa bħala medja ± SEM.
Fl-analiżi tagħna, il-kataboliżmu tal-BCAA sar wieħed mill-mogħdijiet ewlenin ta' up-regulation. Dan il-fatt jissuġġerixxi bil-qawwa li l-volum tal-ventilazzjoni li jidħol fiċ-ċiklu tat-TCA jista' jinbidel f'PN nieqsa minn OXPHOS. Dan jista' jirrappreżenta forma ewlenija ta' rewiring metaboliku newronali, li jista' jkollu impatt dirett fuq il-fiżjoloġija newronali u s-sopravivenza matul iż-żamma ta' disfunzjoni severa ta' OXPHOS. Konsistenti ma' din l-ipoteżi, sibna li l-enzima anti-aterosklerotika ewlenija PCx hija up-regulated (Mfn2cKO/CTRL tinbidel madwar 1.5 darbiet; Figura 3A), li tikkatalizza l-konverżjoni ta' pyruvate għal oxaloacetate (28), li huwa maħsub li jinsab fit-tessut tal-moħħ. L-espressjoni f' hija ristretta għall-astroċiti (29, 30). Konsistenti mar-riżultati tal-proteomika, il-mikroskopija konfokali wriet li l-espressjoni ta' PCx żdiedet speċifikament u b'mod sinifikanti f'PNs defiċjenti f'OXPHOS, filwaqt li r-reattività ta' PCx kienet prinċipalment ristretta għaċ-ċelloli gliali ta' Bergmann biswit tal-kontroll (Figura 3B). Biex nittestjaw b'mod funzjonali r-regolazzjoni 'l fuq osservata tal-PCx, ittrattajna flieli ċerebellari akuti bi traċċatur [1-13C]piruvat. Meta l-piruvat ġie ossidizzat minn pyruvate dehydrogenase (PDH), it-tikketta tal-iżotopu tiegħu sparixxiet, iżda hija inkorporata fl-intermedjati taċ-ċiklu TCA meta l-piruvat jiġi metabolizzat minn reazzjonijiet vaskulari (Figura 3D). B'appoġġ għad-dejta proteomika tagħna, osservajna numru kbir ta' markaturi minn dan it-traċċatur fl-aċidu aspartiku tal-flieli Mfn2cKO, filwaqt li l-aċidu ċitriku u l-aċidu maliku kellhom ukoll xejra moderata, għalkemm mhux sinifikanti (Figura 3D).
Fin-newroni tad-dopamina tal-ġrieden MitoPark b'disfunzjoni mitokondrijali kkawżata minn newroni tad-dopamina li jeqirdu speċifikament il-ġene tal-fattur ta' traskrizzjoni mitokondrijali A (Tfam) (Figura S6B), l-espressjoni tal-PCx kienet ukoll regolata b'mod sinifikanti 'l fuq (31), li jindika li l-arterjosklerożi tal-aċidu aċetun. L-okkorrenza tal-marda hija regolata matul id-disfunzjoni tal-OXPHOS newronali fil-ġisem. Ta' min jinnota li nstab li enzimi uniċi (32-34) li jistgħu jiġu espressi fin-newroni li jistgħu jkunu assoċjati mal-arterjosklerożi huma regolati b'mod sinifikanti 'l fuq f'PNs li m'għandhomx OXPHOS, bħal propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA jikkonverti propionyl-CoA għal succinyl-CoA u enzima malika mitokondrijali 3 (ME3), li r-rwol ewlieni tagħha huwa li tirkupra l-piruvat mill-malat (Figura 3, A u C) (33, 35). Barra minn hekk, sibna żieda sinifikanti fl-enzima Pdk3, li tifosforila u b'hekk tiddiżattiva l-PDH (36), filwaqt li ma nstabu l-ebda bidliet fl-enzima Pdp1 li tattiva l-PDH jew il-kumpless tal-enzima PDH innifsu (Figura 3A). B'mod konsistenti, fil-PNs Mern2cKO, il-fosforilazzjoni tas-subunità α1 α (PDHE1α) subunità tal-komponent E1 tal-pyruvate dehydrogenase tal-kumpless PDH f'Ser293 (magħruf li jinibixxi l-attività tal-enzima tal-PDH) ġiet imsaħħa (Figura S6C) (Figura S6C). Il-piruvat m'għandux aċċess vaskulari.
Fl-aħħar nett, sibna li s-superpass tal-bijosintesi tas-serina u l-gliċina, iċ-ċiklu relatat tal-folat mitokondrijali (1C) u l-bijosintesi tal-prolina (Figura 1G u Figura S5C) huma kollha regolati 'l fuq b'mod sinifikanti, skont rapporti, matul il-proċess ta' attivazzjoni. It-tessuti tal-madwar huma attivati ​​b'disfunzjoni mitokondrijali (5-7). Analiżi konfokali li tappoġġja din id-dejta proteomika wriet li f'PN b'OXPHOS nieqes, flieli ċerebellari ta' ġrieden ta' 8 ġimgħat ġew soġġetti għal serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), enzima ewlenija taċ-ċiklu mitokondrijali tal-folat. Rispons immuni sinifikanti (Figura S5D). Fi 13-il flieli ċerebellari akuti inkubati b'CU-glukożju, esperimenti ta' traċċar metaboliku kkonfermaw aktar ir-regolazzjoni 'l fuq tal-bijosintesi tas-serina u l-prolina, li jindikaw li l-fluss ta' isoformi tal-karbonju fis-serina u l-prolina żdied (Figura S5E). Peress li r-reazzjonijiet promossi minn GLS u GPT2 huma responsabbli għas-sintesi tal-glutamat mill-glutamina u t-transaminazzjoni bejn il-glutamat u l-α-ketoglutarat, ir-regolazzjoni 'l fuq tagħhom tindika li n-newroni defiċjenti fl-OXPHOS għandhom domanda akbar għall-glutamat, Dan jista' jkun immirat lejn iż-żamma tal-bijosintesi akbar tal-prolina (Figura S5C). B'kuntrast ma' dawn il-bidliet, analiżi proteomika tal-astroċiti ċerebellari minn ġrieden Mfn2cKO speċifiċi għall-PN uriet li dawn il-mogħdijiet (inklużi l-antiperossidażi kollha) ma nbidlux b'mod sinifikanti fl-espressjoni, u b'hekk juru li din ir-ridirezzjoni metabolika hija selettiva għall-PN degradata (Fig. S6, D sa G).
Fil-qosor, dawn l-analiżijiet żvelaw mudelli sinifikament differenti ta' attivazzjoni temporali ta' mogħdijiet metaboliċi speċifiċi fil-PNs. Għalkemm funzjoni mitokondrijali newronali anormali tista' twassal għal aterosklerożi bikrija u rimodelljar 1C (Figura 3E u Figura S5C), u anke bidliet prevedibbli fl-espressjoni tal-kumpless I u IV, il-bidliet fis-sintesi de novo tas-serina huma biss Saru apparenti biss fl-istadji tard. Disfunzjoni OXPHOS (Figura 3E u Figura S5C). Dawn is-sejbiet jiddefinixxu proċess sekwenzjali li fih ir-rispons mitokondrijali (ċiklu 1C) u ċitoplasmiku (bijosintesi tas-serina) indott mill-istress jinteraġixxu b'mod sinerġiku maż-żieda fl-aterosklerożi fiċ-ċiklu TCA biex isawru mill-ġdid il-metaboliżmu newronali.
PNs defiċjenti fl-OXPHOS ta' 8 ġimgħat jistgħu jżommu attività ta' eċċitazzjoni ta' frekwenza għolja u jgħaddu minn rikonnessjoni metabolika sinifikanti biex jikkumpensaw għad-disfunzjoni mitokondrijali. Din l-iskoperta tqajjem possibbiltà interessanti li anke f'dan il-mument, dawn iċ-ċelloli jistgħu wkoll jirċievu intervent terapewtiku biex idewwmu jew jipprevjenu n-newrodeġenerazzjoni tard. Irriżolvejna din il-possibbiltà permezz ta' żewġ interventi indipendenti. Fl-ewwel metodu, iddisinjajna vettur tal-virus adeno-assoċjat (AAV) dipendenti fuq Cre sabiex MFN2 ikun jista' jiġi espress b'mod selettiv f'PNs defiċjenti fl-OXPHOS in vivo (Figura S7A). L-AAV li jikkodifika MFN2 u l-ġene reporter fluworexxenti mCherry (Mfn2-AAV) ġew verifikati f'kulturi primarji tan-newroni in vitro, li kkawżaw li MFN2 jiġi espress b'mod dipendenti fuq Cre u salvaw il-morfoloġija mitokondrijali, u b'hekk jipprevjenu n-newromutazzjoni fin-newroni Mfn2cKO (Figura S7, B, D u E). Sussegwentement, wettaqna esperimenti in vivo biex inwasslu b'mod stereotattiku Mfn2-AAV ta' 8 ġimgħat lill-kortiċi ċerebellari ta' ġrieden Mfn2cKO u ta' kontroll, u analizzajna ġrieden ta' 12-il ġimgħa (Figura 4A). Il-ġrieden Mfn2cKO ttrattati mietu (Figura 1, A u B) (16). It-trasduzzjoni virali in vivo rriżultat f'espressjoni selettiva ta' PN f'xi ċrieki ċerebellari (Figura S7, G u H). L-injezzjoni tal-AAV ta' kontroll li tesprimi biss mCherry (Ctrl-AAV) ma kellha l-ebda effett sinifikanti fuq il-grad ta' newrodeġenerazzjoni fl-annimali Mfn2cKO. B'kuntrast, l-analiżi ta' Mfn2cKOs trasdotti b'Mfn2-AAV uriet effett protettiv sinifikanti tas-saff taċ-ċelluli PN (Figura 4, B u C). B'mod partikolari, id-densità tan-newroni tidher li kważi ma tistax tiġi distinta mill-annimali ta' kontroll (Figura 4, B u C, u Figura S7, H u I). L-espressjoni ta' MFN1 iżda mhux MFN2 hija ugwalment effettiva biex issalva l-mewt newronali (Figura 4C u Figura S7, C u F), li jindika li l-espressjoni ta' MFN1 ektopiku tista' tissupplimenta b'mod effettiv in-nuqqas ta' MFN2. Analiżi ulterjuri fil-livell ta' PN wieħed uriet li Mfn2-AAV fil-biċċa l-kbira salva l-ultrastruttura tal-mitokondrija, innormalizza l-livelli ta' mtDNA, u rrevoka l-espressjoni għolja tal-markatur anti-anġjoġenesi PCx ​​(Figura 4, C sa E). Spezzjoni viżwali tal-ġrieden Mfn2cKO salvati fi stat ta' mistrieħ uriet li l-qagħda u s-sintomi tal-mutur tagħhom (moviment S1 sa S3) tjiebu. Bħala konklużjoni, dawn l-esperimenti juru li l-introduzzjoni mill-ġdid ittardjata ta' MFN2 f'PNs b'defiċjenza severa f'OXPHOS hija biżżejjed biex ireġġa' lura l-konsum tal-mtDNA u tinduċi l-aterosklerożi, u b'hekk tipprevjeni d-deġenerazzjoni tal-assoni u l-mewt newronali in vivo.
(A) Skema li turi l-iskeda sperimentali għall-injezzjoni ta' AAV li jikkodifika MFN2 meta l-passaġġ metaboliku indikat jiġi attivat. (B) Immaġni konfokali rappreżentattivi ta' flieli ċerebellari ta' 12-il ġimgħa trasdotti fi 8 ġimgħat f'ġrieden Mfn2cKO u mmarkati b'antikorp anti-Calbindin. Lemin: Skalar tal-fibri tal-assoni. L-iskala taż-żum tal-assoni hija 450 u 75 μm. (Ċ) Xellug: Kwantifikazzjoni tad-densità taċ-ċelluli Purkinje fil-linja tat-trasduzzjoni AAV (AAV+) (analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda; n = 3 ġrieden). Lemin: analiżi tal-fokus tal-mtDNA f'PN trasdott fil-ġimgħa 12 (test-t mhux imqabbad; n = 6 ċelluli minn tliet ġrieden). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Mikrografi elettroniċi ta' trasmissjoni rappreżentattivi ta' PNs ta' sezzjonijiet ċerebellari Mfn2cKO trasdotti bil-vetturi virali indikati. Il-maskra roża turi ż-żona okkupata mid-dendriti, u l-kwadru isfar bit-tikek juri ż-żum ipprovdut fuq il-lemin; n tirrappreżenta n-nukleu. L-iskala, 1μm. (E) turi eżempju ta' tebgħa PCx f'PN trasdott fi 12-il ġimgħa. L-iskala, 20μm. OE, espressjoni żejda; FC, bidla fil-ħin.
Fl-aħħar nett, investigajna l-importanza tas-sopravivenza taċ-ċelluli indotta mill-perossidażi f'PNs li esperjenzaw disfunzjoni OXPHOS. Iġġenerajna mCherry li jikkodifika AAV-shRNA (RNA short hairpin) li jimmira speċifikament lejn l-mRNA tal-PCx tal-ġrieden (AAV-shPCx), u injettajna l-virus jew il-kontroll imħawwad tiegħu (AAV-scr) fiċ-ċerebellum tal-ġrieden Mfn2cKO. L-injezzjoni twettqet fir-raba' ġimgħa tal-età (Figura 5A) biex tinkiseb tnaqqis effettiv tal-PCx matul il-perjodu meta l-espressjoni tal-PCx żdiedet (Figura 3C) u s-saff taċ-ċelluli PN kien għadu intatt (Figura 1A). Ta' min jinnota li t-tnaqqis tal-PCx (Figura S8A) iwassal għal aċċelerazzjoni sinifikanti tal-mewt tal-PN, li hija limitata għaċ-ċirku infettat (Figura 5, B u C). Sabiex nifhmu l-mekkaniżmu tal-effetti metaboliċi kkaġunati mir-regolazzjoni 'l fuq tal-PCx, studjajna l-istatus redox tal-PNs wara t-tnaqqis tal-PCx u l-bijosensur ottiku medjat mill-AAV Grx1-roGFP2 ġew espressi simultanjament (Figura S8, B sa D) biex nevalwaw il-bidla relattiva tal-potenzjal redox tal-peptidi tal-glutathione (38). Imbagħad, wettaqna mikroskopija tal-immaġini tal-fluworexxenza tul il-ħajja b'żewġ fotoni (FLIM) fi flieli akuti tal-moħħ ta' Mfn2cKO ta' 7 ġimgħat jew ta' frieħ ta' kontroll biex niskopru bidliet potenzjali fl-istatus redox ċitoplasmiku wara li vverifikajna l-kundizzjonijiet tal-FLIM (Figura S8, E sa G). L-analiżi wriet żieda sinifikanti fl-istat ta' ossidazzjoni ta' PNs Mfn2cKO singoli li m'għandhomx espressjoni tal-PCx, li hija differenti minn newroni ta' kontroll jew PNs Mfn2cKO li jesprimu biss shRNA mħawwad (Figura 5, D u E). Meta l-espressjoni tal-PCx ġiet regolata 'l isfel, il-perċentwal ta' Mfn2cKO PNs li wrew stat ossidizzat ħafna żdied b'aktar minn tliet darbiet (Figura 5E), u dan jindika li r-regolazzjoni 'l fuq tal-PCx żammet il-kapaċità redox tan-newroni deġenerati.
(A) Skema li turi l-iskeda sperimentali għall-injezzjoni ta' AAV li jikkodifika shPCx meta l-passaġġ metaboliku indikat jiġi attivat. (B) Ritratti konfokali rappreżentattivi ta' sezzjonijiet ċerebellari ta' 8 ġimgħat f'ġrieden Mfn2cKO trasdotti u mmarkati b'antikorp anti-kalċinewrina f'4 ġimgħat. Skala bar, 450μm. (Ċ) Kwantifikazzjoni tad-densità taċ-ċelluli Purkinje f'linji trasdotti minn AAV (analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda; n = 3 sa 4 ġrieden). Id-dejta hija espressa bħala medja±SEM; ***P<0.001. (D) Stampa FLIM rappreżentattiva turi l-ħajja medja ta' PN ta' 7 ġimgħat li jesprimi s-senser redox tal-glutathione Grx1-roGFP2 taħt il-kundizzjonijiet sperimentali speċifikati. Proporzjon LUT (tabella ta' tfittxija): intervall ta' żmien ta' sopravivenza (f'picosekondi). Skala bar, 25μm. (E) L-istogramma turi d-distribuzzjoni tal-valuri tal-ħajja ta' Grx1-roGFP2 minn (D) (n=158 sa 368 ċellula f'żewġ ġrieden taħt kull kundizzjoni). Iċ-ċart 'il fuq minn kull istogramma: turi n-numru ta' ċelloli b'valuri tal-ħajja sinifikament itwal (ħomor, ossidizzati) jew iqsar (blu, imnaqqsa), li jaqbżu 1 SD tal-valur medju tal-ħajja f'CTRL-AAV-scr. (F) Il-mudell propost juri l-effett protettiv tar-regolazzjoni 'l fuq tal-PCx newronali.
Kollox ma’ kollox, id-dejta li nipprovdu hawn turi li l-espressjoni mill-ġdid ta’ MFN2 tista’ ssalva kompletament PN avvanzata b’defiċjenza severa ta’ OXPHOS, tnaqqis sever ta’ mtDNA, u morfoloġija estremament anormali simili għal ista, u b’hekk tipprovdi progress kontinwu anke f’mard avvanzat. In-newrodeġenerazzjoni tipprovdi evidenza riversibbli tal-istadju qabel il-mewt taċ-ċelluli. Dan il-grad ta’ flessibilità metabolika huwa enfasizzat aktar mill-abbiltà tan-newroni li jinduċu aterosklerożi (rewiring taċ-ċiklu TCA), li tinibixxi l-espressjoni ta’ PCx f’PNs li m’għandhomx OXPHOS u ssaħħaħ il-mewt taċ-ċelluli, u b’hekk għandha rwol protettiv (Figura 5F).
F'dan l-istudju, ipprovdejna evidenza li r-rispons tal-PNs għad-disfunzjoni tal-OXPHOS huwa li jikkonverġu gradwalment għall-aterosklerożi taċ-ċiklu TCA permezz tal-mogħdija ta' attivazzjoni differenzjali attivata minn programmi metaboliċi. Ikkonfermajna l-analiżi proteomika b'ħafna metodi komplementari u żvelajna li meta jiġu sfidati minn disfunzjoni mitokondrijali severa, in-newroni għandhom forma ta' elastiċità metabolika li qabel ma kinitx magħrufa. Għal sorpriża tagħna, il-proċess kollu ta' rewiring mhux neċessarjament jimmarka l-istat metaboliku terminali li jakkumpanja n-newrodeġenerazzjoni gradwalment u b'mod irriversibbli, iżda d-dejta tagħna tissuġġerixxi li jista' jikkostitwixxi mekkaniżmu ta' kumpensazzjoni funzjonali tan-newroni ta' manutenzjoni anke fl-istadju ta' qabel il-mewt taċ-ċelluli. Din is-sejba tindika li n-newroni għandhom grad konsiderevoli ta' plastiċità metabolika fil-ġisem. Dan il-fatt juri li l-introduzzjoni mill-ġdid aktar tard ta' MFN2 tista' treġġa' lura l-espressjoni ta' markaturi metaboliċi ewlenin u tipprevjeni d-deġenerazzjoni tal-PN. Għall-kuntrarju, tinibixxi l-aterosklerożi u taċċelera n-nervituri transesswali.
Waħda mill-aktar sejbiet affaxxinanti fir-riċerka tagħna hija li l-PNs li m'għandhomx OXPHOS jistgħu jimmodifikaw il-metaboliżmu taċ-ċiklu tat-TCA billi jżidu l-enzimi li jistimulaw speċifikament l-arterjosklerożi. Ir-riarranġament metaboliku huwa karatteristika komuni taċ-ċelloli tal-kanċer, li wħud minnhom jiddependu fuq il-glutamina biex tissupplimenta intermedjarji taċ-ċiklu tat-TCA biex jipproduċu ekwivalenti li jnaqqsu, li jmexxu l-katina respiratorja u jżommu l-produzzjoni ta' prekursuri tal-bijosintesi tal-lipidi u n-nukleotidi (39, 40). Studju reċenti wera li fit-tessuti periferali li jesperjenzaw disfunzjoni tal-OXPHOS, ir-rikonnessjoni tal-metaboliżmu tal-glutamina/glutamat hija wkoll karatteristika prominenti (5, 41), fejn id-direzzjoni tad-dħul tal-glutamina fiċ-ċiklu tat-TCA tiddependi fuq Minħabba s-severità tal-ħsara tal-OXPHOS (41). Madankollu, hemm nuqqas ta' evidenza ċara dwar kwalunkwe xebh tal-plastiċità metabolika newronali fil-ġisem u r-rilevanza possibbli tagħha fil-kuntest tal-marda. Fi studju reċenti in vitro, intwera li n-newroni kortikali primarji jimmobilizzaw ġabriet ta' glutamat għan-newrotrażmissjoni, u b'hekk jippromwovu l-metaboliżmu ossidattiv u l-aterosklerożi taħt kundizzjonijiet ta' stress metaboliku (42). Ta' min jinnota li taħt l-inibizzjoni farmakoloġika tal-enzima taċ-ċiklu TCA succinate dehydrogenase, il-karbossilazzjoni tal-piruvat hija maħsuba li żżomm is-sintesi tal-oxaloacetate f'newroni tal-granuli ċerebellari kkultivati ​​(34). Madankollu, ir-rilevanza fiżjoloġika ta' dawn il-mekkaniżmi għat-tessut tal-moħħ (fejn l-aterosklerożi hija maħsuba li hija prinċipalment limitata għall-astroċiti) għad għandha sinifikat fiżjoloġiku importanti (43). F'dan il-każ, id-dejta tagħna turi li l-PNs bil-ħsara mill-OXPHOS fil-ġisem jistgħu jinqalbu għad-degradazzjoni tal-BCAA u l-karbossilazzjoni tal-piruvat, li huma ż-żewġ sorsi ewlenin ta' supplimentazzjoni ta' intermedji tal-ġabra TCA. Għalkemm ġie propost il-kontribut putattiv tal-kataboliżmu tal-BCAA għall-metaboliżmu tal-enerġija newronali, minbarra r-rwol tal-glutamate u l-GABA għan-newrotrażmissjoni (44), għad m'hemm l-ebda evidenza għal dawn il-mekkaniżmi in vivo. Għalhekk, huwa faċli li wieħed jispekula li l-PNs li ma jaħdmux sew jistgħu awtomatikament jikkumpensaw għall-konsum ta' intermedji TCA mmexxija mill-proċess ta' assimilazzjoni billi jżidu l-aterosklerożi. B'mod partikolari, ir-regolazzjoni 'l fuq tal-PCx tista' tkun meħtieġa biex tinżamm domanda akbar għall-aċidu aspartiku, li hija ssuġġerita f'ċelloli proliferanti b'disfunzjoni mitokondrijali (45). Madankollu, l-analiżi metabolomika tagħna ma żvelat l-ebda bidla sinifikanti fil-livell ta' stat fiss tal-aċidu aspartiku fil-PNs Mfn2cKO (Figura S6A), li preżumibbilment jirrifletti l-użu metaboliku differenti tal-aċidu aspartiku bejn iċ-ċelloli proliferanti u n-newroni post-mitotiċi. Għalkemm il-mekkaniżmu eżatt tar-regolazzjoni 'l fuq tal-PCx f'newroni disfunzjonali in vivo għad irid jiġi kkaratterizzat, urejna li din ir-rispons prematur għandu rwol importanti fiż-żamma tal-istat redox tan-newroni, li ġie muri f'esperimenti FLIM fuq flieli ċerebellari. B'mod partikolari, il-prevenzjoni tal-PNs milli jirregolaw 'il fuq il-PCx tista' twassal għal stat aktar ossidizzat u taċċellera l-mewt taċ-ċelloli. L-attivazzjoni tad-degradazzjoni tal-BCAA u l-karbossilazzjoni tal-piruvat mhumiex modi kif jiġu kkaratterizzati t-tessuti periferali tad-disfunzjoni mitokondrijali (7). Għalhekk, jidhru li huma karatteristika prijoritarja tan-newroni defiċjenti fl-OXPHOS, anke jekk mhux l-unika karatteristika, li hija importanti għan-newrodeġenerazzjoni. .
Il-marda ċerebellari hija tip eteroġenju ta’ marda newrodeġenerattiva li ġeneralment timmanifesta ruħha bħala atassija u spiss tagħmel ħsara lill-PNs (46). Din il-popolazzjoni ta’ newroni hija partikolarment vulnerabbli għal disfunzjoni mitokondrijali għaliex id-deġenerazzjoni selettiva tagħhom fil-ġrieden hija biżżejjed biex tirriproduċi ħafna mis-sintomi tal-mutur li jikkaratterizzaw l-atassija spinocerebellari umana (16, 47, 48). Skont rapporti, mudell ta’ ġurdien transġeniku b’ġene mutant huwa assoċjat ma’ atassija spinocerebellari umana u għandu disfunzjoni mitokondrijali (49, 50), u dan jenfasizza l-importanza li jiġu studjati l-konsegwenzi tad-defiċjenza ta’ OXPHOS fil-PNPH. Għalhekk, huwa partikolarment adattat li tiġi iżolata u studjata b’mod effettiv din il-popolazzjoni unika ta’ newroni. Madankollu, minħabba li l-PNs huma sensittivi ħafna għall-pressjoni u jammontaw għal proporzjon baxx tal-popolazzjoni kollha taċ-ċelluli ċerebellari, għal ħafna studji bbażati fuq l-omiċi, is-separazzjoni selettiva tagħhom bħala ċelluli sħaħ għadha aspett ta’ sfida. Għalkemm huwa kważi impossibbli li tinkiseb nuqqas assolut ta' kontaminazzjoni ta' tipi oħra ta' ċelluli (speċjalment tessuti adulti), għaqqadna pass effettiv ta' dissoċjazzjoni mal-FACS biex niksbu numru suffiċjenti ta' newroni vijabbli għall-analiżi proteomika downstream, u għandna kopertura ta' proteini pjuttost għolja (madwar 3000 proteina) meta mqabbla mas-sett ta' dejta eżistenti taċ-ċerebellum kollu (51). Billi nippreservaw il-vijabbiltà taċ-ċelluli sħaħ, il-metodu li nipprovdu hawn jippermettilna mhux biss li nivverifikaw il-bidliet fil-mogħdijiet metaboliċi fil-mitokondrija, iżda wkoll li nivverifikaw il-bidliet fil-kontropartijiet ċitoplasmiċi tagħha, li jikkumplimenta l-użu ta' tikketti tal-membrana mitokondrijali biex jarrikkixxu t-tip ta' ċellula. Il-metodu l-ġdid għan-numru ta' mitokondrija f'tessuti kumplessi (52, 53). Il-metodu li niddeskrivu mhux biss huwa relatat mal-istudju taċ-ċelluli ta' Purkinje, iżda jista' jiġi applikat faċilment għal kwalunkwe tip ta' ċellula biex jindirizza l-bidliet metaboliċi f'imħuħ morda, inklużi mudelli oħra ta' disfunzjoni mitokondrijali.
Fl-aħħar nett, identifikajna tieqa terapewtika matul dan il-proċess ta' riarranġament metaboliku li tista' ireġġa' lura kompletament is-sinjali ewlenin ta' stress ċellulari u tipprevjeni d-deġenerazzjoni newronali. Għalhekk, il-fehim tal-implikazzjonijiet funzjonali tar-riwajering deskritt hawnhekk jista' jipprovdi għarfien fundamentali dwar trattamenti possibbli biex tinżamm il-vijabbiltà newronali matul disfunzjoni mitokondrijali. Riċerka futura mmirata lejn l-analiżi tal-bidliet fil-metaboliżmu tal-enerġija f'tipi oħra ta' ċelluli tal-moħħ hija meħtieġa biex tiżvela bis-sħiħ l-applikabbiltà ta' dan il-prinċipju għal mard newroloġiku ieħor.
Ġrieden MitoPark ġew deskritti qabel (31). Ġrieden C57BL/6N b'ġeni Mfn2 li jdawru loxP ġew deskritti qabel (18) u mqassma ma' ġrieden L7-Cre (23). Il-frieħ eterożiguti doppji li rriżultaw imbagħad ġew imqassma ma' ġrieden omożiguti Mfn2loxP/Mfn2loxP biex jiġġeneraw knockouts tal-ġeni speċifiċi għal Purkinje għal Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). F'sottosett ta' tgħammir, l-allel Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) ġie introdott permezz ta' qsim addizzjonali (20). Il-proċeduri kollha fuq l-annimali twettqu skont il-linji gwida Ewropej, nazzjonali u istituzzjonali u ġew approvati minn LandesamtfürNatur ta' Umwelt u Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, il-Ġermanja. Ix-xogħol fuq l-annimali jsegwi wkoll il-gwida tal-Federazzjoni Ewropea tal-Assoċjazzjonijiet tax-Xjenzi tal-Annimali tal-Laboratorju.
Wara li ġiet anestetizzata d-dislokazzjoni ċervikali tal-mara tqila, l-embrijun tal-ġrieden ġie iżolat (E13). Il-kortiċi ġiet dissezzjonata f'Soluzzjoni tal-Melħ Ibbilanċjata ta' Hanks (HBSS) supplimentata b'10 mM Hepes u mgħoddija fuq Dulbecco's Modified Eagle's Medium li fih papain (20 U/ml) u cysteine ​​​​(1μg/ml). Inkuba t-tessut f'DMEM) u ddiżossoċjah permezz ta' diġestjoni enżimatika. Ml) f'37°C għal 20 minuta, u mbagħad mitħun mekkanikament f'DMEM supplimentat b'10% serum bovin fetali. Iċ-ċelloli ġew miżrugħa fuq coverslips tal-ħġieġ miksija bil-polilisina b'densità ta' 2×106 għal kull dixx tal-kultura ta' 6 ċm jew b'densità ta' 0.5×105 ċelluli/cm2 għall-analiżi tal-immaġini. Wara 4 sigħat, il-mezz ġie sostitwit b'mezz mingħajr serum Neurobasal li fih 1% suppliment B27 u 0.5 mM GlutaMax. In-newroni mbagħad inżammu f'temperatura ta' 37°C u 5% CO2 matul l-esperiment kollu, u ngħataw l-ikel darba fil-ġimgħa. Sabiex tiġi indotta r-rikombinazzjoni in vitro, 3μl (dixx tal-kultura b'24-bir) jew 0.5μl (pjanċa b'24-bir) tal-vettur tal-virus AAV9 li ġej intuża biex jiġu ttrattati n-newroni fit-tieni jum in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, numru tal-katalogu 105530-AAV9) u AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, numru tal-katalogu 105545-AAV9).
Id-DNA komplementari tal-ġrieden Mfn1 u Mfn2 (miksub mill-plasmid Addgene #23212 u #23213, rispettivament) huma mmarkati bis-sekwenza V5 (GKPINPLLGLDST) fit-tarf C, u huma magħqudin ma' mCherry fil-qafas permezz tas-sekwenza T2A. Grx1-roGFP2 huwa rigal minn Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Billi l-cassette tdTomato ġiet sostitwita bl-użu ta' metodi konvenzjonali ta' klonazzjoni, il-cassette ġiet sottoklonata fl-iskeletru pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (numru ta' referenza Addgene 28306) biex tiġġenera vetturi pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 u pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Strateġija simili ntużat biex tiġġenera l-vettur ta' kontroll pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Sabiex tiġġenera l-kostruzzjoni AAV-shPCx, huwa meħtieġ vettur AAV tal-plasmid (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), li fih is-sekwenza tad-DNA li tikkodifika x-shRNA li timmira lejn il-PCx tal-ġrieden (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Taħt il-kontroll tal-promotur U6, mCherry jintuża taħt il-kontroll tal-promotur CMV. Il-produzzjoni ta' vettori AAV awżiljarji twettqet skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur (Cell Biolabs). Fil-qosor, uża plasmid ta' trasferiment li jġorr mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) b'mod temporanju. Trasfezzjoni tal-ġene li jikkodifika ċ-ċelloli 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) jew Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), kif ukoll li jikkodifika l-proteina tal-kapsid AAV1 u l-plasmid tal-ippakkjar tal-proteina aċċessorja, bl-użu tal-metodu tal-fosfat tal-kalċju. Is-supernatant tal-virus mhux raffinat inkiseb permezz ta' ċikli ta' ffriżar-tidwib f'banju tas-silġ niexef/etanol u ċelloli liżati f'salina b'buffer tal-fosfat (PBS). Il-vettur AAV ġie ppurifikat permezz ta' ultraċentrifugazzjoni ta' gradjent ta' jodixanol mhux kontinwu (24 siegħa f'32,000 rpm u 4°C) u kkonċentrat bl-użu ta' filtru ċentrifugali Amicon ultra-15. It-titru tal-ġenoma ta' AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 kopja tal-ġenoma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX kien kif deskritt qabel (54), imkejjel permezz ta' PCR kwantitattiva f'ħin reali (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) u AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
In-newroni primarji tneħħew f'1x PBS kiesaħ bis-silġ, ġew imfarrka, u mbagħad omoġenizzati f'0.5% Triton X-100 / 0.5% sodium deoxycholate/PBS li fih fosfatase u inibitur tal-protease (Roche). Il-kwantifikazzjoni tal-proteini twettqet bl-użu tal-assaġġ tal-aċidu biċinkoniniku (Thermo Fisher Scientific). Il-proteini mbagħad ġew separati permezz ta' elettroforesi bil-ġel SDS-polyacrylamide, u mbagħad ġew imnixxfa fuq membrana tal-poliviniliden fluworidu (GE Healthcare). Imblokka s-siti mhux speċifiċi u inkuba mal-antikorp primarju (ara t-Tabella S1 għad-dettalji) f'ħalib ta' 5% f'TBST (salina Tris-buffered bit-Tween), passi ta' ħasil u antikorp sekondarju f'TBST Inkubate. Inkuba bl-antikorp primarju matul il-lejl f'+4°C. Wara l-ħasil, applika l-antikorp sekondarju għal sagħtejn f'temperatura tal-kamra. Sussegwentement, billi inkuba l-istess imnixxef b'antikorp anti-β-actin, l-istess tagħbija ġiet ikkonfermata. Sejbien billi jiġi kkonvertit għal kemiluminexxenza u tittejjeb il-kemiluminexxenza (GE Healthcare).
In-newroni li qabel kienu miżrugħa fuq coverslips tal-ħġieġ ġew iffissati b'4% paraformaldehyde (PFA)/PBS fil-ħin speċifikat f'temperatura tal-kamra għal 10 minuti. Il-coverslips l-ewwel jiġu permeati b'0.1% Triton X-100/PBS għal 5 minuti f'temperatura tal-kamra, u mbagħad f'blocking buffer [3% bovine serum albumin (BSA)/PBS]. Fit-tieni jum, il-coverslips inħaslu b'blocking buffer u ġew inkubati bl-antikorp sekondarju xieraq konjugat mal-fluoroforu għal sagħtejn f'temperatura tal-kamra; fl-aħħar, il-kampjuni nħaslu sewwa f'PBS b'4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) li jiġi kontro-miżbugħ u mbagħad iffissat fuq is-slajd tal-mikroskopju b'Aqua-Poly/Mount.
Ġrieden (irġiel u nisa) ġew anestetizzati permezz ta' injezzjoni intraperitoneali ta' ketamina (130 mg/kg) u xylazine (10 mg/kg) u ngħataw taħt il-ġilda b'analġeżiku carprofen (5 mg/kg), u tqiegħdu fi strument stereotattiku (Kopf) mgħammar b'kuxxinett sħun. Esponi l-kranju u uża trapan dentali biex irqaq il-parti tal-kortiċi ċerebellari li tikkorrispondi mal-għadma mis (minn lambda: denb 1.8, laterali 1, li tikkorrispondi għal-lobuli IV u V). Uża labra tas-siringa mgħawġa biex toħloq toqba żgħira bir-reqqa fil-kranju biex tevita li tfixkel il-vaskulatura ta' taħt. Imbagħad il-kapillari rqiq tal-ħġieġ miġbud jiddaħħal bil-mod fil-mikro-toqba (minn -1.3 sa -1 fuq in-naħa ventrali tad-dura mater), u 200 sa 300 nl AAV jiġu injettati fil-mikro-injettur (Narishige) b'siringi manwali (Narishige) diversi drabi bi pressjoni baxxa fuq perjodu ta' żmien ta' 10 sa 20 minuta. Wara l-infużjoni, poġġi l-kapillari għal 10 minuti oħra biex tħalli l-virus jinfirex kompletament. Wara li l-kapillari jitneħħew, il-ġilda tiġi suturata bir-reqqa biex timminimizza l-infjammazzjoni tal-ferita u tħalli l-annimal jirkupra. L-annimali ġew ittrattati b'analġeżiċi (caspofen) għal diversi jiem wara l-operazzjoni, li matulhom il-kundizzjoni fiżika tagħhom ġiet immonitorjata bir-reqqa u mbagħad ġew ewtanizzati fil-ħin iddikjarat. Il-proċeduri kollha twettqu skont il-linji gwida Ewropej, nazzjonali u istituzzjonali u ġew approvati minn LandesamtfürNatur ta' Umwelt u Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, il-Ġermanja.
L-annimali ġew anestetizzati b'ketamina (100 mg/kg) u xylazine (10 mg/kg), u l-qalb ġiet perfuża l-ewwel b'0.1 M PBS, u mbagħad b'4% PFA f'PBS. It-tessut ġie dissezzjonat u ffissat f'4% PFA/PBS matul il-lejl f'4°C. Sikkina li tivvibra (Leica Microsystems GmbH, Vjenna, l-Awstrija) intużat biex tipprepara sezzjonijiet sagittali (50 μm ħxuna) mill-moħħ iffissat fil-PBS. Sakemm ma jkunx speċifikat mod ieħor, it-tebgħa tas-sezzjonijiet li jżommu f'wiċċ l-ilma twettqet kif deskritt hawn fuq (13) f'temperatura tal-kamra u waqt li tħawwad. Fil-qosor, l-ewwel, il-flieli miksuba ġew permeabilizzati b'0.5% Triton X-100/PBS għal 15-il minuta f'temperatura tal-kamra; għal xi epitopi (Pcx u Shmt2), billi saħħan il-flieli f'buffer tris-EDTA f'80°C (PH 9) għal 25 minuta minflok dan il-pass. Imbagħad, is-sezzjonijiet ġew inkubati b'antikorp primarju (ara Tabella S1) f'buffer tal-ibblokkar (3% BSA/PBS) f'4°C matul il-lejl waqt li tħawwad. L-għada, is-sezzjonijiet inħaslu b'buffer tal-ibblokkar u ġew inkubati bl-antikorp sekondarju xieraq konjugat mal-fluworoforu għal sagħtejn f'temperatura tal-kamra; fl-aħħar, is-sezzjonijiet inħaslu sewwa fil-PBS, ġew kontra-mtebbgħin b'DAPI, u mbagħad iffissati b'AquaPolymount fuq slide tal-mikroskopju.
Mikroskopju konfokali tal-iskannjar bil-lejżer (TCS SP8-X jew TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) mgħammar b'lejżer tad-dawl abjad u lejżer ultravjola b'dijodu 405 intuża biex jieħu immaġni tal-kampjun. Billi eċċita l-fluworoforu u ġabar is-sinjal b'Hybrid Detector (HyDs), is-softwer LAS-X intuża biex jiġbor immaġni f'munzelli li jikkonformaw mal-kampjunar ta' Nyquist f'modalità sekwenzjali: għal pannelli mhux kwantitattivi, huma sinjali dinamiċi ħafna (pereżempju, f'ċelloli somatiċi u dendriti) mtYFP) Uża HyD biex tiskopri n-numru ta' PNs fil-modalità BrightR). Jiġi applikat gating minn 0.3 sa 6 ns biex jitnaqqas l-isfond.
Immaġini f'ħin reali ta' ċelloli magħżula. Wara l-issortjar f'mezz Neurobasal-A li fih 1% suppliment B27 u 0.5 mM GlutaMax, iċ-ċelloli ġew immedjatament miżrugħa fuq slajds tal-ħġieġ miksija bil-poly-l-lysine (μ-Slide8 Well, Ibidi, numru tal-katalgu 80826), u mbagħad inżammu f'temperatura ta' 37°C u 5% CO2 għal siegħa biex iċ-ċelloli jkunu jistgħu joqogħdu. L-immaġini f'ħin reali twettqet fuq mikroskopju konfokali tal-iskannjar bil-lejżer Leica SP8 mgħammar b'lejżer abjad, HyD, lenti oġġettiva taż-żejt ta' 63×[1.4 apertura numerika (NA)] u stadju tat-tisħin.
Il-ġurdien ġie anestetizzat malajr bid-dijossidu tal-karbonju u dekapitat, il-moħħ tneħħa malajr mill-kranju, u nqata’ f’sezzjoni sagittali ta’ 200μm ħxuna (għall-esperiment tat-tikkettar 13C) jew 275μm ħxuna (għal esperimenti b’żewġ fotoni) mimlija bil-materjali li ġejjin. Il-ġelat (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, il-Ġermanja) huwa mimli bis-sustanzi li ġejjin: 125 mM kiesaħ silġ, saturat bil-karbonju (95% O2 u 5% CO2) b’livell baxx ta’ Ca2 + fluwidu ċerebrospinali artifiċjali (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM buffer tas-sodium phosphate, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukożju, 0.5 mM CaCl2 u 3.5 mM MgCl2 (pressjoni osmotika ta’ 310 sa 330 mmol). Ittrasferixxi l-flieli tal-moħħ miksuba għal kamra ta' qabel l-inkubazzjoni li fiha Mezz ogħla ta' Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 u 2.0 mM MgCl2) pH 7.4 u 310 sa 320 mmol).
Matul il-proċess tal-immaġini, il-flieli tmexxew f'kamra tal-immaġini ddedikata, u l-esperiment twettaq taħt perfużjoni kontinwa tal-ACSF f'temperatura kostanti ta' 32° sa 33°C. Għall-immaġini tal-flieli ntuża mikroskopju tal-iskannjar bil-lejżer multifoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) mgħammar b'lenti oġġettiva Leica 25x (NA 0.95, ilma), u laser Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent). Modulu FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM ta' Grx1-roGFP2. Il-bidliet fl-istat redox ċitoplasmiku tal-PNs tkejlu permezz ta' FLIM b'żewġ fotoni f'biċċiet sagittali tal-moħħ, fejn il-bijosensur Grx1-roGFP2 immira lejn il-PNs. Fis-saff tal-PN, il-kamp tal-akkwist jintgħażel madwar 50 sa 80 μm taħt il-wiċċ tal-biċċa biex jiġi żgurat li jkun hemm PN vijabbli (jiġifieri, in-nuqqas ta' struttura b'żibeġ jew bidliet morfoloġiċi newronali tul id-dendriti) u s-sensur roGFP2 doppju pożittiv u l-AAV li jikkodifika shRNA PCx jew is-sekwenza ta' kontroll tagħha (kull waħda tesprimi flimkien mCherry). Iġbor immaġini minn munzell wieħed b'żum diġitali 2x [tul ta' mewġa ta' eċċitazzjoni: 890 nm; 512 nm 512 pixel]. Sejbien: HyD intern, grupp ta' filtru tal-fluworexxeina isotijoċjanat (FITC)] u medja tal-immaġini fi żmien 2 sa 3 minuti jintużaw biex jiġi żgurat li jinġabru biżżejjed fotoni (1000 foton b'kollox) għat-twaħħil tal-kurva. Is-sensittività tas-sonda Grx1-roGFP2 u l-verifika tal-kundizzjonijiet FLIM twettqu billi ġie mmonitorjat il-valur tal-ħajja ta' roGFP2 meta żdiedet 10 mM H2O2 eżoġenu mal-ACSF tal-perfużjoni (biex tiġi massimizzata l-ossidazzjoni, li tirriżulta f'żieda fil-ħajja), u mbagħad żdiedu 2 mM dithiothreitol (jimminimizza l-grad ta' tnaqqis, li jirriżulta fi tnaqqis fil-ħajja) (Figura S8, D sa G). Uża s-softwer FLIMfit 5.1.1 biex tanalizza r-riżultati miksuba, waħħal il-kurva ta' tħassir esponenzjali waħda tal-immaġni kollha mal-IRF imkejjel (funzjoni ta' rispons tal-istrument), u χ2 hija bejn wieħed u ieħor 1. Biex tiġi kkalkulata l-ħajja ta' PN waħda, il-maskra madwar il-ġisem tan-nervituri tfasslet manwalment, u l-ħajja medja f'kull maskra ntużat għall-kwantifikazzjoni.
Analiżi tal-potenzjal mitokondrijali. Wara li s-sezzjoni akuta ġiet inkubata b'100 nM TMRM miżjud direttament mal-ACSF perfużat għal 30 minuta, il-bidliet fil-potenzjal mitokondrijali tal-PNs tkejlu b'mikroskopju b'żewġ fotoni. L-immaġini TMRM twettqet billi s-sonda ġiet eċċitata f'920 nm u ntużat HyD interna (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) biex jinġabru s-sinjali; billi ntużat l-istess wavelength ta' eċċitazzjoni iżda ntużat HyD interna differenti (FITC: 525/50) biex tinħoloq immaġni ta' mtYFP. Uża l-plug-in Image Calculator ta' ImageJ biex tevalwa l-potenzjal mitokondrijali fil-livell taċ-ċellula waħda. Fil-qosor, l-ekwazzjoni tal-plug-in: sinjal = min (mtYFP, TMRM) tintuża biex tidentifika r-reġjun mitokondrijali li juri s-sinjal TMRM f'Purkinje Somali fl-immaġni konfokali b'munzell wieħed tal-kanal korrispondenti. Imbagħad iż-żona tal-pixel fil-maskra li tirriżulta tiġi kwantifikata, u mbagħad normalizzata fuq l-immaġni ta' munzell wieħed bil-limitu korrispondenti tal-kanal mtYFP biex tinkiseb il-frazzjoni mitokondrijali li turi l-potenzjal mitokondrijali.
L-immaġni ġiet dekonvoluta bis-softwer Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Għar-ritratti skenjati tal-madum, il-montaġġ ta' maduma waħda jsir bl-użu tal-algoritmu awtomatiku tal-ħjata pprovdut mis-softwer LAS-X. Wara l-kalibrazzjoni tal-immaġni, uża ImageJ u Adobe Photoshop biex tipproċessa aktar l-immaġni u aġġusta b'mod uniformi l-luminożità u l-kuntrast. Uża Adobe Illustrator għat-tħejjija grafika.
Analiżi tal-fokus tal-mtDNA. In-numru ta' leżjonijiet tal-mtDNA ġie kwantifikat fuq sezzjonijiet ċerebellari mmarkati b'antikorpi kontra d-DNA permezz ta' mikroskopju konfokali. Kull żona fil-mira nħolqot għall-ġisem taċ-ċellula u n-nukleu ta' kull ċellula, u ż-żona rispettiva ġiet ikkalkulata bl-użu tal-plug-in Multi Measure (softwer ImageJ). Naqqas iż-żona nukleari miż-żona tal-ġisem taċ-ċellula biex tikseb iż-żona ċitoplasmika. Fl-aħħar nett, il-plug-in Analyze Particles (softwer ImageJ) intuża biex jikkwantifika awtomatikament il-punti tad-DNA ċitoplasmika li jindikaw l-mtDNA fuq l-immaġni limitu, u r-riżultati miksuba ġew normalizzati għall-medja PN tal-ġrieden CTRL. Ir-riżultati huma espressi bħala n-numru medju ta' nukleosidi għal kull ċellula.
Analiżi tal-espressjoni tal-proteini. Uża l-plug-in Image Calculator ta' ImageJ biex tevalwa l-espressjoni tal-proteini fil-PN fil-livell taċ-ċellula waħda. Fil-qosor, fl-immaġni konfokali ta' saff wieħed tal-kanal korrispondenti, permezz tal-ekwazzjoni: sinjal = min (mtYFP, antikorp), ir-reġjun mitokondrijali li juri immunoreattività għal ċertu antikorp f'Purkina jiġi identifikat. Imbagħad iż-żona tal-pixel fil-maskra li tirriżulta tiġi kwantifikata, u mbagħad normalizzata fuq l-immaġni ta' munzell wieħed bil-limitu korrispondenti tal-kanal mtYFP biex tinkiseb il-frazzjoni mitokondrijali tal-proteina murija.
Analiżi tad-densità taċ-ċelluli ta' Purkinje. Il-plug-in Cell Counter ta' ImageJ intuża biex tiġi evalwata d-densità ta' Purkinje billi n-numru ta' ċelluli ta' Purkinje magħduda ġie diviż bit-tul taċ-ċirku ċerebellari okkupat miċ-ċelluli magħduda.
Tħejjija u ġbir ta' kampjuni. L-imħuħ mill-grupp ta' kontroll u l-ġrieden Mfn2cKO ġew iffissati f'2% PFA/2.5% glutaraldehyde f'0.1 M phosphate buffer (PB), u mbagħad is-sezzjonijiet koronali ġew ippreparati bl-użu ta' ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vjenna, l-Awstrija) (Ħxuna 50 sa 60 μm). Imbagħad ġew iffissati f'PB buffer f'1% os tetraoxide u 1.5% potassium ferrocyanide f'temperatura tal-kamra għal siegħa. Is-sezzjonijiet inħaslu tliet darbiet b'ilma distillat, u mbagħad ġew imtebbgħin b'70% etanol li fih 1% uranyl acetate għal 20 minuta. Is-sezzjonijiet imbagħad ġew deidratati f'alkoħol gradat u inkorporati f'reżina epossidika Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, numru tal-katalgu 14040) bejn slajds tal-ħġieġ miksija bis-silikon, u finalment f'60°C ġew polimerizzati fil-forn għal 48 siegħa. Iż-żona tal-kortiċi ċerebellari ntgħażlet u sezzjonijiet ultrarqaq ta' 50 nm inqatgħu fuq Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vjenna, l-Awstrija) u ttieħdu fuq gradilja tar-ram b'qasma ta' 2×1 mm miksija b'film tal-polistirene. Is-sezzjonijiet ġew imtebbgħin b'soluzzjoni ta' 4% uranyl acetate f'H2O għal 10 minuti, maħsula b'H2O diversi drabi, imbagħad b'Reynolds lead citrate f'H2O għal 10 minuti, u mbagħad maħsula b'H2O diversi drabi. Il-mikrografi ttieħdu b'mikroskopju elettroniku ta' trasmissjoni Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bl-użu ta' kamera diġitali TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Il-Ġermanja).
Għal ġrieden infettati bl-AAV, il-moħħ ġie separat u mqatta’ f’sezzjoni sagittali ta’ 1 mm ħxuna, u ċ-ċerebellum ġie eżaminat bl-użu ta’ mikroskopju tal-fluworexxenza biex jiġi identifikat iċ-ċirku infettat bl-AAV (jiġifieri, li jesprimi mCherry). Intużaw biss esperimenti li fihom l-injezzjoni tal-AAV tirriżulta f’effiċjenza għolja ħafna ta’ trasduzzjoni tas-saff taċ-ċelluli ta’ Purkinje (jiġifieri kważi s-saff kollu) f’mill-inqas żewġ ċrieki ċerebellari konsekuttivi. Il-linja trasdotta bl-AAV ġiet mikrodissezzjonata għal wara l-iffissar matul il-lejl (4% PFA u 2.5% glutaraldehyde f’0.1 M buffer tal-kokoat) u pproċessata aktar. Għall-inkorporazzjoni tal-EPON, it-tessut fiss inħasel b’0.1 M buffer tal-kokoat tas-sodju (Applicihem), u ġie inkubat b’2% OsO4 (os, Science Services; Caco) f’0.1 M buffer tal-kokoat tas-sodju (Applicihem) għal 4 sigħat, imbagħad inħasel għal sagħtejn. Irrepeti 3 darbiet b’0.1 M buffer tal-kokamid. Sussegwentement, is-serje axxendenti ta' etanol intużat biex tinkuba kull soluzzjoni ta' etanol f'4°C għal 15-il minuta biex tiddeidrata t-tessut. It-tessut ġie trasferit għal ossidu tal-propilene u inkubat matul il-lejl f'EPON (Sigma-Aldrich) f'4°C. Poġġi t-tessut f'EPON frisk f'temperatura tal-kamra għal sagħtejn, u mbagħad poġġih f'62°C għal 72 siegħa. Uża ultramikrotomu (Leica Microsystems, UC6) u sikkina tad-djamanti (Diatome, Biel, l-Iżvizzera) biex taqta' sezzjonijiet ultrarqaq ta' 70 nm, u żebgħa b'1.5% uranyl acetate għal 15-il minuta f'37°C, u żebgħa b'soluzzjoni taċ-ċitrat taċ-ċomb għal 4 minuti. Il-mikrografi elettroniċi ttieħdu bl-użu ta' mikroskopju elettroniku ta' trasmissjoni JEM-2100 Plus (JEOL) mgħammar b'Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) u s-softwer DigitalMicrograph (Gatan). Għall-analiżi, inkisbu mikrografi elettroniċi b'żum diġitali ta' 5000× jew 10,000×.
Analiżi morfoloġika tal-mitokondrija. Għall-analiżijiet kollha, il-kontorni tal-mitokondrija individwali ġew imfassla manwalment f'immaġini diġitali bl-użu tas-softwer ImageJ. Jiġu analizzati parametri morfoloġiċi differenti. Id-densità mitokondrijali hija espressa bħala perċentwal miksub billi l-erja mitokondrijali totali ta' kull ċellula tiġi diviża bl-erja taċ-ċitoplasma (erja taċ-ċitoplasma = erja taċ-ċellula - erja tan-nukleu taċ-ċellula) × 100. Ir-rotondità tal-mitokondrija hija kkalkulata bil-formula [4π∙(erja/perimetru 2)]. Il-morfoloġija ista tal-mitokondrija ġiet analizzata u maqsuma f'żewġ kategoriji ("tubulari" u "blister") skont il-forom ewlenin tagħhom.
Analiżi tan-numru u d-densità tal-awtofagosomi/liżosomi. Uża s-softwer ImageJ biex tiddeskrivi manwalment il-kontorni ta' kull awtofagosoma/liżosoma fl-immaġni diġitali. L-erja tal-awtofagosoma/liżosoma hija espressa bħala perċentwal ikkalkulat billi l-erja totali tal-istruttura tal-awtofagosoma/liżosoma ta' kull ċellula tiġi diviża bl-erja taċ-ċitoplasma (erja taċ-ċitoplasma = erja taċ-ċellula - erja tan-nukleu) × 100. Id-densità tal-awtofagosomi/liżosomi hija kkalkulata billi n-numru totali jiġi diviż bin-numru ta' strutturi tal-awtofagosomi/liżosoma għal kull ċellula (f'termini ta' erja ċitoplasmika) (erja ċitoplasmika = erja taċ-ċellula - erja nukleari).
Tikkettar għal sezzjonijiet akuti u preparazzjoni tal-kampjuni. Għal esperimenti li jeħtieġu tikkettar tal-glukożju, ittrasferixxi l-flieli akuti tal-moħħ għal kamra ta' qabel l-inkubazzjoni, li fiha karbonju saturat (95% O2 u 5% CO2), Ca2 + ACSF għoli (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM buffer tas-sodju fosfat, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukożju, 1.0 mM CaCl2 u 2.0 mM MgCl2, aġġustat għal pH 7.4 u 310 sa 320 mOsm), fejn il-glukożju huwa sostituzzjoni tal-glukożju 13C6- (Eurisotop, numru tal-katalgu CLM-1396). Għal esperimenti li jeħtieġu tikkettar bil-piruvat, ittrasferixxi l-flieli akuti tal-moħħ għal Ca2 + ACSF ogħla (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM buffer tas-sodium phosphate, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 u żid 2.0mM MgCl2, aġġusta għal pH 7.4 u 310 sa 320mOsm), u żid 1mM 1-[1-13C]piruvat (Eurisotop, numru tal-katalgu CLM-1082). Inkuba s-sezzjonijiet għal 90 minuta f'37°C. Fi tmiem l-esperiment, is-sezzjonijiet inħaslu malajr b'soluzzjoni milwiema (pH 7.4) li fiha 75 mM ammonju karbonat, u mbagħad ġew omoġenizzati f'40:40:20 (v:v:v) aċetonitrile (ACN): metanol: ilma. Wara li s-sezzjonijiet ġew inkubati fuq is-silġ għal 30 minuta, il-kampjuni ġew ċentrifugati f'21,000 g għal 10 minuti f'4°C, u s-supernatant ċar tnixxef f'konċentratur SpeedVac. Il-gerbub tal-metabolit imnixxef li rriżulta nħażen f'-80°C sakemm sar l-analiżi.
Analiżi tal-kromatografija likwida-spettrometrija tal-massa ta' aċidi amminiċi mmarkati b'13C. Għall-analiżi tal-kromatografija likwida-spettrometrija tal-massa (LC-MS), il-gerbub tal-metabolit ġie sospiż mill-ġdid f'75μl ta' ilma ta' grad LC-MS (Honeywell). Wara ċentrifugazzjoni f'21,000 g għal 5 minuti f'4°C, 20 μl tas-supernatant iċċarat intuża għall-analiżi tal-fluss tal-aċidi amminiċi, filwaqt li l-bqija tal-estratt intuża immedjatament għall-analiżi tal-anjoni (ara hawn taħt). L-analiżi tal-aċidi amminiċi twettqet bl-użu tal-protokoll tad-derivatizzazzjoni tal-klorur tal-benżojl deskritt qabel (55, 56). Fl-ewwel pass, 10μl ta' 100 mM karbonat tas-sodju (Sigma-Aldrich) ġew miżjuda ma' 20μl ta' estratt tal-metabolit, u mbagħad 10μl ta' 2% klorur tal-benżojl (Sigma-Aldrich) ġew miżjuda mal-ACN ta' grad LC. Il-kampjun ġie vortexed fil-qosor u mbagħad iċċentrifugat f'21,000 g għal 5 minuti f'20°C. Ittrasferixxi s-supernatant imnaddaf għal kunjett ta' awtokampjunatur ta' 2 ml b'inserit koniku tal-ħġieġ (volum ta' 200 μl). Il-kampjuni ġew analizzati bl-użu tas-sistema LC ta' prestazzjoni ultra-għolja Acquity iClass (Waters) imqabbda mal-ispettrometru tal-massa ta' preċiżjoni b'riżoluzzjoni għolja Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Għall-analiżi, 2 μl tal-kampjun derivatizzat ġew injettati f'kolonna tas-silika T3 ta' saħħa għolja ta' 100 × 1.0 mm (Waters) li fiha partiċelli ta' 1.8 μm. Ir-rata tal-fluss hija 100 μl/min, u s-sistema buffer tikkonsisti minn buffer A (10 mM format tal-ammonju u 0.15% aċidu formiku fl-ilma) u buffer B (ACN). Il-gradjent huwa kif ġej: 0%B f'0 minuti; 0%B. 0 sa 15% B f'0 sa 0.1 minuti; 15 sa 17% B f'0.1 sa 0.5 minuti; B f'17 sa 55% f'0.5 sa 14-il minuta; B f'55 sa 70% f'14 sa 14.5 minuti; f'14.5 sa 70 sa 100% B f'18-il minuta; 100% B f'18 sa 19-il minuta; 100 sa 0% B f'19 sa 19.1 minuti; 0% B f'19.1 sa 28 minuta (55, 56). L-ispettrometru tal-massa QE-HF jopera f'modalità ta' jonizzazzjoni pożittiva b'firxa ta' massa ta' m/z (proporzjon massa/ċarġ) ta' 50 sa 750. Ir-riżoluzzjoni applikata hija ta' 60,000, u l-mira tal-jone tal-kontroll tal-qligħ (AGC) miksuba hija ta' 3×106, u l-ħin massimu tal-jone huwa ta' 100 millisekonda. Is-sors ta' jonizzazzjoni elettrosprej imsaħħan (ESI) jopera b'vultaġġ ta' sprej ta' 3.5 kV, temperatura kapillari ta' 250°C, fluss tal-arja tal-għant ta' 60 AU (unitajiet arbitrarji), u fluss tal-arja awżiljarju ta' 20 AU. 250°C. Il-lenti S hija ssettjata għal 60 AU.
Analiżi tal-kromatografija anjonika-MS ta' aċidi organiċi mmarkati b'13C. Il-preċipitat tal-metabolit li fadal (55μl) ġie analizzat bl-użu ta' sistema ta' kromatografija jonika Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) imqabbda ma' spettrometru tal-massa QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Fil-qosor, 5μl ta' estratt tal-metabolit ġew injettati f'kolonna Dionex IonPac AS11-HC mgħammra b'HPLC (2 mm × 250 mm, daqs tal-partiċelli 4μm, Thermo Fisher Scientific) f'modalità ta' linja parzjali push-in b'proporzjon ta' mili ta' 1.) Kolonna ta' protezzjoni Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). It-temperatura tal-kolonna tinżamm fi 30°C, u l-awtokampjunatur huwa ssettjat għal 6°C. Uża kartriġ tal-idrossidu tal-potassju pprovdut b'ilma dejonizzat biex tiġġenera gradjent tal-idrossidu tal-potassju permezz tal-ġeneratur tal-eluwent. Separazzjoni tal-metaboliti b'rata ta' fluss ta' 380μl/min, bl-applikazzjoni tal-gradjent li ġej: 0 sa 3 minuti, 10 mM KOH; 3 sa 12-il minuta, 10 sa 50 mM KOH; 12 sa 19-il minuta, 50 sa 100 mM KOH; 19 sa 21 minuta, 100 mM KOH; 21 sa 21.5 minuti, 100 sa 10 mM KOH. Il-kolonna ġiet ekwilibrata mill-ġdid taħt 10 mM KOH għal 8.5 minuti.
Il-metaboliti elużati huma kkombinati ma' nixxiegħa ta' suppliment ta' isopropanol ta' 150μl/min wara l-kolonna u mbagħad diretti lejn spettrometru tal-massa b'riżoluzzjoni għolja li jopera fil-modalità ta' jonizzazzjoni negattiva. L-MS qed jimmonitorja l-firxa tal-massa minn m/z 50 sa 750 b'riżoluzzjoni ta' 60,000. L-AGC huwa ssettjat għal 1×106, u l-ħin massimu tal-jone jinżamm f'100 ms. Is-sors ESI msaħħan kien imħaddem b'vultaġġ ta' sprej ta' 3.5 kV. Is-settings l-oħra tas-sors tal-jone huma kif ġej: temperatura kapillari 275°C; fluss tal-gass tal-għant, 60 AU; fluss tal-gass awżiljarju, 20 AU fi 300°C, u setting tal-lenti S għal 60 AU.
Analiżi tad-dejta tal-metaboliti mmarkati b'13C. Uża s-softwer TraceFinder (verżjoni 4.2, Thermo Fisher Scientific) għall-analiżi tad-dejta tal-proporzjon tal-iżotopi. L-identità ta' kull kompost ġiet ivverifikata minn kompost ta' referenza affidabbli u analizzata b'mod indipendenti. Sabiex titwettaq l-analiżi tal-arrikkiment tal-iżotopi, iż-żona tal-kromatogramma tal-jone estratt (XIC) ta' kull iżotopu 13C (Mn) ġiet estratta minn [M + H] +, fejn n huwa n-numru tal-karbonju tal-kompost fil-mira, użat biex jiġu analizzati l-aċidi amminiċi jew [MH] + jintuża biex jiġu analizzati l-anjoni. L-eżattezza tal-massa ta' XIC hija inqas minn ħames partijiet kull miljun, u l-eżattezza ta' RT hija ta' 0.05 minuti. L-analiżi tal-arrikkiment titwettaq billi jiġi kkalkulat il-proporzjon ta' kull iżotopu skopert għas-somma tal-iżotopi kollha tal-kompost korrispondenti. Dawn il-proporzjonijiet huma mogħtija bħala valuri perċentwali għal kull iżotopu, u r-riżultati huma espressi bħala arrikkiment perċentwali molari (MPE), kif deskritt qabel (42).
Il-gerbub tan-newroni ffriżat ġie omoġenizzat f'metanol ta' 80% (v/v) kiesaħ bis-silġ, imħawwad bil-vortex, u inkubat f'temperatura ta' -20°C għal 30 minuta. Erġa' ħawwad il-kampjun bil-vortex u ħawwad f'temperatura ta' +4°C għal 30 minuta. Il-kampjun ġie ċċentrifugat f'21,000 g għal 5 minuti f'4°C, u mbagħad is-supernatant li rriżulta nġabar u tnixxef bl-użu ta' konċentratur SpeedVac f'25°C għal analiżi sussegwenti. Kif deskritt hawn fuq, l-analiżi LC-MS twettqet fuq l-aċidi amminiċi taċ-ċelloli magħżula. Bl-użu ta' TraceFinder (verżjoni 4.2, Thermo Fisher Scientific), l-analiżi tad-dejta twettqet bl-użu tal-massa monoisotopika ta' kull kompost. In-normalizzazzjoni kwantili tad-dejta tal-metaboliti twettqet bl-użu tal-pakkett tas-softwer preprocessCore (57).
Tħejjija tal-porzjon. Il-ġurdien ġie anestetizzat malajr bid-dijossidu tal-karbonju u dekapitat, il-moħħ tneħħa malajr mill-kranju, u s-sikkina vibranti mimlija bis-silġ (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, il-Ġermanja) intużat biex taqtgħu f'sezzjonijiet sagittali ta' 300 sa 375 μm. Gassifikazzjoni tal-karbonju kiesaħ (95% O2 u 5% CO2) Ca2 baxx + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM buffer tas-sodium phosphate, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 u 6.0 mM MgCl2 Aġġusta għal pH 7.4 u 310 sa 330 mOsm). Ittrasferixxi l-flieli tal-moħħ miksuba għal kamra li fiha Ca2 + ACSF ogħla (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM CaCl2 u mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 u 310 sa 320 mOsm). Aħżen il-flieli għal 20 sa 30 minuta sabiex ikunu jistgħu jiġu rrestawrati qabel ir-reġistrazzjoni.
Reġistrazzjoni. Għar-reġistrazzjonijiet kollha ntuża stadju tal-mikroskopju mgħammar b'kamra ta' reġistrazzjoni fissa u lenti oġġettiva ta' immersjoni fl-ilma 20x (Scientifica). Iċ-ċelloli putattivi ta' Purkinje ġew identifikati minn (i) id-daqs tal-ġisem, (ii) il-post anatomiku taċ-ċerebellum, u (iii) l-espressjoni tal-ġene reporter fluworexxenti mtYFP. Il-pipetta tal-garża b'reżistenza tal-ponta ta' 5 sa 11 megohms tinġibed 'il barra minn kapillari tal-ħġieġ borosilikat (GB150-10, 0.86 mm × 1.5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, il-Ġermanja) u pipetta orizzontali Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Ir-reġistrazzjonijiet kollha twettqu permezz ta' amplifikatur tal-garża tal-morsa npi ELC-03XS (npi electronic GmbH, Tam, il-Ġermanja), li kien ikkontrollat ​​mis-softwer Signal (verżjoni 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, ir-Renju Unit). L-esperiment ġie rreġistrat b'rata ta' kampjunar ta' 12.5 kHz. Is-sinjal huwa ffiltrat b'żewġ filtri Bessel short-pass bi frekwenzi cutoff ta' 1.3 u 10 kHz rispettivament. Il-kapaċitanza tal-membrana u l-pipetta hija kkumpensata miċ-ċirkwit ta' kumpensazzjoni bl-użu tal-amplifikatur. L-esperimenti kollha twettqu taħt il-kontroll ta' kamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, il-Ġermanja), li kienet ikkontrollata mis-softwer Hokawo (verżjoni 2.8, Hamamatsu, Gerden, il-Ġermanja).
Konfigurazzjoni u analiżi ta' rutina taċ-ċelluli sħaħ. Immedjatament qabel ir-reġistrazzjoni, imla l-pipetta bis-soluzzjoni interna li fiha s-sustanzi li ġejjin: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM glukonat tal-potassju, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) u 10.0 mM creatinine phosphate ġew aġġustati għal pH 7.25, u l-pressjoni osmotika kienet 290 mOsm (sukrożju). Immedjatament wara l-applikazzjoni ta' forza ta' 0 pA biex tinqasam il-membrana, tkejjel il-potenzjal tal-membrana mistrieħa. Ir-reżistenza tad-dħul titkejjel billi jiġu applikati kurrenti iperpolarizzati ta' -40, -30, -20, u -10 pA. Kejjel il-kobor tar-rispons tal-vultaġġ u uża l-liġi ta' Ohm biex tikkalkula r-reżistenza tad-dħul. L-attività spontanja ġiet irreġistrata f'morsa tal-vultaġġ għal 5 minuti, u l-sPSC ġiet identifikata u mkejla f'Igor Pro (verżjoni 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) bl-użu ta' skript ta' rikonoxximent semi-awtomatiku. Il-kurva IV u l-kurrent fi stat fiss jitkejlu billi l-batterija tiġi kklampjata f'potenzjali differenti (li jibdew minn -110 mV) u l-vultaġġ jiżdied fi passi ta' 5 mV. Il-produzzjoni tal-AP ġiet ittestjata bl-applikazzjoni ta' kurrent depolarizzanti. Ikklampja ċ-ċellula f'-70 mV waqt li tapplika impuls ta' kurrent depolarizzanti. Aġġusta d-daqs tal-pass ta' kull unità ta' reġistrazzjoni separatament (10 sa 60 pA). Ikkalkula l-frekwenza massima tal-AP billi tgħodd manwalment il-ponot tal-impuls li jikkawżaw l-ogħla frekwenza tal-AP. Il-limitu tal-AP jiġi analizzat billi tintuża t-tieni derivattiva tal-impuls ta' depolarizzazzjoni li l-ewwel jattiva AP wieħed jew aktar.
Konfigurazzjoni u analiżi tal-garża mtaqqba. Wettaq reġistrazzjoni tal-garża mtaqqba bl-użu ta' protokolli standard. Uża pipetta ħielsa mill-ATP u l-GTP li ma fihax l-ingredjenti li ġejjin: 128 mM glukonat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA u 2 mM MgCl2, u aġġusta għal pH 7.2 (bl-użu ta' KOH). L-ATP u l-GTP jitħallew barra mis-soluzzjoni intraċellulari biex jipprevjenu l-permeabilità mhux ikkontrollata tal-membrana taċ-ċellula. Il-pipetta tal-garża timtela b'soluzzjoni interna li fiha l-amfoteriċina (madwar 200 sa 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) biex tikseb rekord tal-garża mtaqqba. L-amfoteriċina ġiet maħlula fid-dimetil sulfossidu (konċentrazzjoni finali: 0.1 sa 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Il-konċentrazzjoni tad-DMSO użata ma kellha l-ebda effett sinifikanti fuq in-newroni studjati. Matul il-proċess tat-titqib, ir-reżistenza tal-kanal (Ra) ġiet immonitorjata kontinwament, u l-esperiment inbeda wara li l-amplitudni ta' Ra u AP stabbilizzaw ruħhom (20-40 minuta). L-attività spontanja titkejjel f'morsa tal-vultaġġ u/jew tal-kurrent għal 2 sa 5 minuti. L-analiżi tad-dejta twettqet bl-użu ta' Igor Pro (verżjoni 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (verżjoni 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) u GraphPad Prism (verżjoni 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). (Stati Uniti). Sabiex jiġu identifikati l-APs spontanei, jintuża l-plug-in NeuroMatic v3.0c ta' IgorPro. Identifika awtomatikament l-APs bl-użu ta' limitu partikolari, li jiġi aġġustat individwalment għal kull rekord. Bl-użu tal-intervall tal-ispike, iddetermina l-frekwenza tal-ispike bil-frekwenza massima istantanja tal-ispike u l-frekwenza medja tal-ispike.
Iżolament tal-PN. Billi jadattaw għall-protokoll ippubblikat qabel, il-PNs ġew purifikati miċ-ċerebellum tal-ġrieden fi stadju speċifikat (58). Fil-qosor, iċ-ċerebellum ġie dissezzjonat u mqatta’ f’mezz ta’ dissoċjazzjoni kiesaħ silġ [mingħajr HBSS Ca2+ u Mg2+, supplimentat b’20 mM glukożju, peniċillina (50 U/ml) u streptomiċina (0.05 mg/ml)], u mbagħad il-mezz ġie diġerit f’papain [HBSS, supplimentat b’1-cysteine·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) u deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)]. Ittratta għal 30 minuta f’temperatura ta’ 30°C. L-ewwel aħsel it-tessuti f'mezz HBSS li fih mukus tal-bajd (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) u DNase (0.1 mg/ml) f'temperatura tal-kamra biex tevita d-diġestjoni enżimatika, u mbagħad fil-mezz HBSS li fih 20 mM glukożju. Tħin bil-mod f'HBSS, peniċillina (50 U/ml), streptomycin (0.05 mg/ml) u DNase (0.1 mg/ml) biex tirrilaxxa ċelloli singoli. Is-sospensjoni taċ-ċelloli li rriżultat ġiet iffiltrata minn passatur taċ-ċelloli ta' 70μm, imbagħad iċ-ċelloli ġew imfarrka permezz ta' ċentrifugazzjoni (1110 rpm, 5 minuti, 4°C) u sospiżi mill-ġdid f'mezz ta' għażla [HBSS, supplimentat b'20 mM glukożju, 20% fetu bovin) Serum, peniċillina (50 U/ml) u streptomycin (0.05 mg/ml)]; evalwa l-vijabbiltà taċ-ċelloli bil-jodur tal-propidju u aġġusta d-densità taċ-ċelloli għal 1×106 sa 2×106 ċelloli/ml. Qabel iċ-ċitometrija tal-fluss, is-sospensjoni ġiet iffiltrata minn passatur taċ-ċelluli ta' 50 μm.
Ċitometru tal-fluss. L-issortjar taċ-ċelloli twettqet f'4°C bl-użu tal-magna FACSAria III (BD Biosciences) u s-softwer FACSDiva (BD Biosciences, verżjoni 8.0.1). Is-sospensjoni taċ-ċelloli ġiet magħżula bl-użu ta' żennuna ta' 100 μm taħt pressjoni ta' 20 psi b'rata ta' ~2800 avveniment/sek. Peress li l-kriterji tradizzjonali tal-gating (id-daqs taċ-ċelloli, id-diskriminazzjoni bimodali, u l-karatteristiċi tat-tifrix) ma jistgħux jiżguraw l-iżolament korrett tal-PN minn tipi oħra ta' ċelloli, l-istrateġija tal-gating hija stabbilita abbażi tal-paragun dirett tal-intensità tal-YFP u l-awtofluworexxenza fil-ġrieden mitoYFP+ ​​​​u l-kontroll mitoYFP −. L-YFP huwa eċċitat billi l-kampjun jiġi irradjat b'linja tal-lejżer ta' 488 nm, u s-sinjal jiġi skopert bl-użu ta' filtru band pass ta' 530/30 nm. Fil-ġrieden mitoYFP+ ​​​​, is-saħħa relattiva tal-ġene reporter Rosa26-mitoYFP tintuża wkoll biex tiddistingwi l-frammenti tal-ġisem newronali u tal-assoni. 7-AAD huwa eċċitat b'lejżer isfar ta' 561 nm u skopert b'filtru bandpass ta' 675/20 nm biex jiġu esklużi ċ-ċelloli mejta. Sabiex jiġu separati l-astroċiti fl-istess ħin, is-sospensjoni taċ-ċelloli ġiet imtebbgħa b'ACSA-2-APC, imbagħad il-kampjun ġie irradjat b'linja tal-lejżer ta' 640 nm, u ntuża filtru bandpass ta' 660/20 nm biex jinstab is-sinjal.
Iċ-ċelloli miġbura ġew ippellettati permezz ta' ċentrifugazzjoni (1110 rpm, 5 minuti, 4°C) u maħżuna f'-80°C sakemm jintużaw. Il-ġrieden Mfn2cKO u l-frieħ tagħhom huma kklassifikati fl-istess jum biex tiġi minimizzata l-varjabbiltà proċedurali. Il-preżentazzjoni u l-analiżi tad-dejta FACS twettqu bl-użu tas-softwer FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Kif imsemmi hawn fuq (59), il-PCR f'ħin reali jintuża biex jiżola d-DNA min-newroni magħżula għall-kwantifikazzjoni sussegwenti tal-mtDNA. Il-linearità u s-sensittività tal-limitu ġew ittestjati inizjalment billi tħaddem qPCR fuq numri differenti ta' ċelloli. Fil-qosor, iġbor 300 PN f'buffer ta' lisi li jikkonsisti minn 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 u proteinase K (200 ng/ml) u inkuba f'55°C għal 120 minuta. Iċ-ċelloli ġew inkubati aktar f'95°C għal 10 minuti biex tiġi żgurata inattivazzjoni kompleta tal-proteinase K. Bl-użu ta' sonda TaqMan (Thermo Fisher) speċifika għal mt-Nd1, l-mtDNA tkejjel permezz ta' PCR semi-kwantitattiva fis-sistema 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Xjenza, numru tal-katalgu Mm04225274_s1), ġeni mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, numru tal-katalgu AIVI3E8) u 18S (Thermo Fisher Scientific, numru tal-katalgu Hs99999901_s1).
Tħejjija ta' kampjun tal-proteoma. Billi ssaħħan is-soluzzjoni f'95°C għal 10 minuti u ssonika, fil-buffer tal-liżi [6 M guanidine chloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide u 100 mM tris-Lise iffriżati neuron pellets f'HCl]. Fuq Bioruptor (Diagenode) għal 10 minuti (30 sekonda pulsazzjoni / 30 sekonda perjodu ta' pawża). Il-kampjun ġie dilwit 1:10 f'20 mM tris-HCl (pH 8.0), imħallat ma' 300 ng trypsin gold (Promega), u inkubat matul il-lejl f'37°C biex tinkiseb diġestjoni kompluta. Fit-tieni jum, il-kampjun ġie ċċentrifugat f'20,000 g għal 20 minuta. Is-supernatant ġie dilwit b'0.1% aċidu formiku, u s-soluzzjoni ġiet demellizzata bi StageTips magħmula mid-dar. Il-kampjun tnixxef fi strument SpeedVac (konċentratur Eppendorf plus 5305) f'45°C, u mbagħad il-peptide ġie sospiż f'0.1% aċidu formiku. Il-kampjuni kollha tħejjew simultanjament mill-istess persuna. Sabiex jiġu analizzati l-kampjuni tal-astroċiti, 4 μg ta' peptidi demelħin ġew ittikkettati b'tikketta tal-massa tandem (TMT10plex, numru tal-katalgu 90110, Thermo Fisher Scientific) b'proporzjon ta' peptide għal reaġent TMT ta' 1:20. Għat-tikkettar TMT, 0.8 mg ta' reaġent TMT ġew sospiżi mill-ġdid f'70 μl ta' ACN anidru, u l-peptide mnixxef ġie rikostitwit f'9 μl ta' 0.1 M TEAB (bikarbonat tat-trietilammonju), li miegħu ġew miżjuda 7 μl ta' reaġent TMT f'ACN. Il-konċentrazzjoni kienet ta' 43.75%. Wara 60 minuta ta' inkubazzjoni, ir-reazzjoni ġiet imkessħa b'2 μl ta' 5% idrossilamina. Il-peptidi ttikkettati nġabru, nixxfu, ġew sospiżi mill-ġdid f'200μl ta' 0.1% aċidu formiku (FA), maqsuma fi tnejn, u mbagħad tneħħielhom il-melħ bl-użu ta' StageTips magħmulin minnhom infushom. Bl-użu ta' kromatografu likwidu ta' prestazzjoni ultra għolja UltiMate 3000 (kromatografu likwidu ta' prestazzjoni ultra għolja UltiMate 3000), waħda miż-żewġ nofsijiet ġiet frazzjonata fuq kolonna kromatografika Acquity ta' 1mm x 150mm mimlija b'partiċelli C18 ta' 130Å1.7μm (Waters, Numru tal-katalgu SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Issepara l-peptidi b'rata ta' fluss ta' 30μl/min, issepara minn buffer B ta' 1% sa 50% għal 85 minuta b'gradjent gradwali ta' 96 minuta, minn buffer B ta' 50% sa 95% għal 3 minuti, imbagħad 8 minuti għal Buffer B ta' 95%; Il-Buffer A huwa 5% ACN u 10 mM ammonium bicarbonate (ABC), u l-buffer B huwa 80% ACN u 10 mM ABC. Iġbor il-frazzjonijiet kull 3 minuti u għaqqadhom f'żewġ gruppi (1 + 17, 2 + 18, eċċ.) u nixxefhom f'ċentrifuga bil-vakwu.
Analiżi LC-MS/MS. Għall-ispettrometrija tal-massa, il-peptidi (numru r119.aq) ġew separati fuq kolonna analitika PicoFrit ta' 25 ċm u 75 μm b'dijametru intern (lenti oġġettiva ġdida, numru tal-parti PF7508250) mgħammra b'mezz ReproSil-Pur 120 C18-AQ ta' 1.9 μm (Dr. Maisch, mat), Uża EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, il-Ġermanja). Il-kolonna nżammet f'50°C. Il-buffers A u B huma 0.1% aċidu formiku fl-ilma u 0.1% aċidu formiku fi 80% ACN, rispettivament. Il-peptidi ġew separati minn 6% sa 31% buffer B għal 65 minuta u minn 31% sa 50% buffer B għal 5 minuti b'gradjent ta' 200 nl/min. Il-peptidi elużi ġew analizzati fuq spettrometru tal-massa Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Il-kejl m/z tal-prekursur tal-peptidi jitwettaq b'riżoluzzjoni ta' 120,000 fil-medda ta' 350 sa 1500 m/z. Bl-użu ta' enerġija ta' ħabta normalizzata ta' 27%, l-aktar prekursur b'saħħtu bi stat ta' ċarġ ta' 2 sa 6 jintgħażel għal qsim ta' dissoċjazzjoni tan-nassa C b'enerġija għolja (HCD). Il-ħin taċ-ċiklu huwa ssettjat għal 1 s. Il-valur m/z tal-framment tal-peptidi tkejjel fin-nassa tal-joni bl-użu tal-iżgħar mira AGC ta' 5×104 u l-ħin massimu ta' injezzjoni ta' 86 ms. Wara l-frammentazzjoni, il-prekursur tqiegħed fuq il-lista ta' esklużjoni dinamika għal 45 s. Il-peptidi mmarkati bit-TMT ġew separati fuq kolonna Acclaim PepMap ta' 50 cm u 75 μm (Thermo Fisher Scientific, numru tal-katalgu 164942), u l-ispettri tal-migrazzjoni ġew analizzati fuq spettrometru tal-massa Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) mgħammar b'tagħmir ta' joni tal-forma ta' mewġa asimmetrika ta' kamp għoli (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) li jopera f'żewġ vultaġġi ta' kumpensazzjoni ta' −50 u −70 V. MS3 magħżul abbażi tal-prekursur tas-sinkronizzazzjoni jintuża għall-kejl tas-sinjal tal-jone tar-rapport TMT. Is-separazzjoni tal-peptidi twettqet fuq EASY-nLC 1200, bl-użu ta' eluzzjoni ta' gradjent lineari ta' 90%, b'konċentrazzjoni ta' buffer ta' 6% sa 31%; buffer A kien 0.1% FA, u buffer B kien 0.1% FA u 80% ACN. Il-kolonna analitika titħaddem f'50°C. Uża FreeStyle (verżjoni 1.6, Thermo Fisher Scientific) biex taqsam il-fajl oriġinali skont il-vultaġġ ta' kumpensazzjoni FAIMS.
Identifikazzjoni u kwantifikazzjoni tal-proteini. Bl-użu tal-magna tat-tiftix integrata Andromeda, id-dejta oriġinali ġiet analizzata bl-użu ta' MaxQuant verżjoni 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Minbarra s-sekwenzi ta' Cre recombinase u YFP miksuba minn Aequorea victoria, l-ispettri tal-frammenti tal-peptidi ġew imfittxija għas-sekwenza kanonika u s-sekwenza tal-isoforma tal-proteoma ta' referenza tal-ġrieden (Proteome ID UP000000589, imniżżel minn UniProt f'Mejju 2017). L-ossidazzjoni tal-methionine u l-aċetilazzjoni N-terminali tal-proteina ġew issettjati bħala modifiki varjabbli; il-metilazzjoni taċ-cysteine ​​​​carbamoyl ġiet issettjata bħala modifiki fissi. Il-parametri tad-diġestjoni huma ssettjati għal "speċifiċità" u "trypsin/P". L-għadd minimu ta' peptidi u peptidi tax-xafra użati għall-identifikazzjoni tal-proteini huwa 1; l-għadd minimu ta' peptidi uniċi huwa 0. Taħt il-kundizzjonijiet tat-tqabbil tal-mappa tal-peptidi, ir-rata ta' identifikazzjoni tal-proteini kienet ta' 0.01. L-għażla "It-Tieni Peptide" hija attivata. Uża l-għażla "match between runs" biex tittrasferixxi identifikazzjonijiet ta' suċċess bejn fajls oriġinali differenti. Uża l-għadd minimu tal-proporzjon LFQ ta' 1 għal kwantifikazzjoni mingħajr tikketta (LFQ) (60). L-intensità tal-LFQ hija ffiltrata għal mill-inqas żewġ valuri validi f'mill-inqas grupp ta' ġenotip wieħed f'kull punt ta' żmien, u hija estrapolata minn distribuzzjoni normali b'wisa' ta' .0.3 u niżżel 1.8. Uża l-pjattaforma tal-kompjuter Perseus (https://maxquant.net/perseus/) u R (https://r-project.org/) biex tanalizza r-riżultati tal-LFQ. Test t moderat f'żewġ direzzjonijiet mill-pakkett tas-softwer limma ntuża għall-analiżi tal-espressjoni differenzjali (61). Analiżi esploratorja tad-dejta titwettaq bl-użu ta' ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally u pheatmap. Id-dejta proteomika bbażata fuq it-TMT ġiet analizzata bl-użu ta' MaxQuant verżjoni 1.6.10.43. Fittex dejta proteomika mhux ipproċessata mid-database tal-proteomika umana ta' UniProt, li tniżżlet f'Settembru 2018. L-analiżi tinkludi l-fattur ta' korrezzjoni tal-purità tal-iżotopi pprovdut mill-manifattur. Uża limma f'R għall-analiżi tal-espressjoni differenzjali. Id-dejta oriġinali, ir-riżultati tat-tfittxija fid-database, u l-fluss tax-xogħol u r-riżultati tal-analiżi tad-dejta huma kollha maħżuna fl-alleanza ProteomeXchange permezz tar-repożitorju tas-sieħeb PRIDE bl-identifikatur tas-sett tad-dejta PXD019690.
L-annotazzjonijiet funzjonali jarrikkixxu l-analiżi. L-għodda Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) intużat biex tiddetermina r-rikkezza tat-termini tal-annotazzjoni funzjonali tas-sett tad-dejta fi 8 ġimgħat (Figura 1). Fil-qosor, il-lista kwantitattiva tal-proteini miksuba mill-analiżi tad-dejta LC-MS/MS (spettrometrija tal-massa tandem) tintuża bil-kriterji tal-filtru li ġejjin: Mus musculus jintgħażel bħala l-ispeċi u l-isfond, u l-kategorija turi li l-valur P aġġustat minn Benjamini għal arrikkiment ta' 0.05 jew inqas huwa kkunsidrat sinifikanti. Għal din il-grafika, jintwerew l-aqwa ħames kategoriji ta' eċċess f'kull raggruppament ibbażati fuq il-valur P aġġustat. Bl-użu ta' t-test multiplu, bl-użu tal-programm ta' spinta lineari f'żewġ stadji ta' Benjamini, Krieger, u Yekutieli (Q = 5%), l-analiżi tal-espressjoni tal-proteini tul iż-żmien titwettaq fuq il-kandidati importanti identifikati f'kull kategorija, u kull ringiela tiġi analizzata separatament. M'hemmx bżonn li jiġi adottat SD konsistenti.
Sabiex inqabblu r-riżultati ta’ dan l-istudju ma’ databases ippubblikati u niġġeneraw dijagramma ta’ Venn fil-Figura 1, għaqqadna l-lista kwantitattiva tal-proteini mal-annotazzjonijiet ta’ MitoCarta 2.0 (24). Uża l-għodda online Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) biex tiġġenera d-dijagramma.
Għal informazzjoni dettaljata dwar il-proċeduri statistiċi użati għall-analiżi proteomika, jekk jogħġbok irreferi għat-taqsima korrispondenti ta' Materjali u Metodi. Għall-esperimenti l-oħra kollha, informazzjoni dettaljata tista' tinstab fil-leġġenda korrispondenti. Sakemm ma jkunx speċifikat mod ieħor, id-dejta kollha hija espressa bħala medja ± SEM, u l-analiżijiet statistiċi kollha twettqu bl-użu tas-softwer GraphPad Prism 8.1.2.
Għal materjali supplimentari għal dan l-artiklu, jekk jogħġbok ara http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Dan huwa artiklu b'aċċess miftuħ imqassam skont it-termini tal-Liċenzja Creative Commons Attribution-Non-Commercial, li tippermetti l-użu, id-distribuzzjoni u r-riproduzzjoni fi kwalunkwe mezz, sakemm l-użu finali ma jkunx għal qligħ kummerċjali u l-premessa hija li x-xogħol oriġinali huwa korrett. Referenza.
Nota: Nitolbuk biss li tipprovdi l-indirizz elettroniku tiegħek sabiex il-persuna li tirrakkomanda lill-paġna tkun taf li tridha tara l-email u li mhijiex spam. Mhux se naqbdu l-ebda indirizz elettroniku.
Din il-mistoqsija tintuża biex tittestja jekk intix viżitatur u tipprevjeni s-sottomissjoni awtomatika ta' spam.
Minn E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
L-analiżi proteomika ta' newroni li ma jaħdmux sew uriet li programmi metaboliċi huma attivati ​​biex jikkontrobattu n-newrodeġenerazzjoni.
Minn E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
L-analiżi proteomika ta' newroni li ma jaħdmux sew uriet li programmi metaboliċi huma attivati ​​biex jikkontrobattu n-newrodeġenerazzjoni.
©2020 Assoċjazzjoni Amerikana għall-Avvanz tax-Xjenza. id-drittijiet kollha riżervati. AAAS hija sieħba ta' HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef u COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.