Grazzi talli żort Nature.com. Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għas-CSS. Għal riżultati aħjar, nirrakkomandaw li tuża verżjoni aktar ġdida tal-browser tiegħek (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibilità fl-Internet Explorer). Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, qed nuru s-sit mingħajr stil jew JavaScript.
L-aċidu propjoniku (PPA) jintuża biex jistudja r-rwol tad-disfunzjoni mitokondrijali f'disturbi newro-żviluppanti bħad-disturb tal-ispettru tal-awtiżmu. Il-PPA huwa magħruf li jfixkel il-bijoġenesi, il-metaboliżmu u t-tibdil mitokondrijali. Madankollu, l-effetti tal-PPA fuq id-dinamika mitokondrijali, il-fissjoni u l-fużjoni jibqgħu problematiċi minħabba n-natura temporali kumplessa ta' dawn il-mekkaniżmi. Hawnhekk, nużaw tekniki kwantitattivi komplementari tal-immaġini biex ninvestigaw kif il-PPA jaffettwa l-ultrastruttura mitokondrijali, il-morfoloġija u d-dinamika f'ċelloli SH-SY5Y simili għan-newroni. Il-PPA (5 mM) ikkawża tnaqqis sinifikanti fiż-żona mitokondrijali (p < 0.01), id-dijametru u ċ-ċirkonferenza ta' Feret (p < 0.05), u ż-żona 2 (p < 0.01). L-analiżi tal-lokatur tal-avvenimenti mitokondrijali wriet żieda sinifikanti (p < 0.05) fl-avvenimenti ta' fissjoni u fużjoni, u b'hekk żammet l-integrità tan-netwerk mitokondrijali taħt kundizzjonijiet ta' stress. Barra minn hekk, l-espressjoni tal-mRNA ta' cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) u OPA1 (p < 0.05) tnaqqset b'mod sinifikanti. 01). Dan juri r-rimudellar tal-morfoloġija, il-bijoġenesi u d-dinamika mitokondrijali biex tinżamm il-funzjoni taħt kundizzjonijiet ta' stress. Id-dejta tagħna tipprovdi għarfien ġdid dwar l-effetti tal-PPA fuq id-dinamika mitokondrijali u tenfasizza l-utilità tat-tekniki tal-immaġini għall-istudju tal-mekkaniżmi regolatorji kumplessi involuti fir-risponsi għall-istress mitokondrijali.
Il-mitokondrija huma parteċipanti integrali f'varjetà ta' funzjonijiet ċellulari lil hinn mir-rwoli tipiċi tagħhom fil-produzzjoni tal-enerġija u l-bijosintesi. Il-metaboliżmu mitokondrijali huwa regolatur ewlieni tas-sinjalar tal-kalċju, l-omeostażi metabolika u redox, is-sinjalar infjammatorju, il-modifiki epiġenetiċi, il-proliferazzjoni taċ-ċelluli, id-differenzjazzjoni u l-mewt ipprogrammata taċ-ċelluli1. B'mod partikolari, il-metaboliżmu mitokondrijali huwa kritiku għall-iżvilupp, is-sopravivenza u l-funzjoni newronali u huwa implikat b'mod wiesa' f'diversi manifestazzjonijiet ta' newropatoloġija2,3,4.
Matul l-aħħar għaxar snin, l-istatus metaboliku ħareġ bħala regolatur ċentrali tan-newroġenesi, id-differenzjazzjoni, il-maturazzjoni u l-plastiċità5,6. Riċentement, il-morfoloġija u d-dinamika mitokondrijali saru komponenti partikolarment importanti tal-mitożi, proċess dinamiku li jżomm grupp ta’ mitokondrija b’saħħitha fiċ-ċelloli. Id-dinamika mitokondrijali hija regolata minn mogħdijiet interdipendenti kumplessi li jvarjaw mill-bijoġenesi u l-bijoenerġetika mitokondrijali sal-fissjoni, il-fużjoni, it-trasport u t-tneħħija mitokondrijali7,8. It-tfixkil ta’ kwalunkwe minn dawn il-mekkaniżmi integrattivi jfixkel iż-żamma ta’ netwerks mitokondrijali b’saħħithom u għandu konsegwenzi funzjonali profondi għall-iżvilupp newroloġiku9,10. Tabilħaqq, id-disregolazzjoni tad-dinamika mitokondrijali hija osservata f’ħafna disturbi psikjatriċi, newrodeġenerattivi u newrożvilupp, inklużi disturbi fl-ispettru tal-awtiżmu (ASD)11,12.
L-ASD hija disturb newrożviluppali eteroġenju b'arkitettura ġenetika u epiġenetika kumplessa. L-ereditabilità tal-ASD mhijiex ikkontestata, iżda l-etjoloġija molekulari sottostanti tibqa' mifhuma ħażin. Id-dejta akkumulata minn mudelli prekliniċi, studji kliniċi, u settijiet ta' dejta molekulari multi-omiċi tipprovdi evidenza dejjem akbar ta' disfunzjoni mitokondrijali fl-ASD13,14. Preċedentement wettaqna skrin tal-metilazzjoni tad-DNA madwar il-ġenoma f'grupp ta' pazjenti bl-ASD u identifikajna ġeni metilati b'mod differenzjali miġbura tul mogħdijiet metaboliċi mitokondrijali15. Sussegwentement irrappurtajna metilazzjoni differenzjali tar-regolaturi ċentrali tal-bijoġenesi u d-dinamika mitokondrijali, li kienet assoċjata ma' żieda fin-numru ta' kopji tal-mtDNA u profil metaboliku urinarju mibdul fl-ASD16. Id-dejta tagħna tipprovdi evidenza dejjem akbar li d-dinamika mitokondrijali u l-omeostażi għandhom rwol ċentrali fil-patofiżjoloġija tal-ASD. Għalhekk, it-titjib tal-fehim mekkanistiku tar-relazzjoni bejn id-dinamika mitokondrijali, il-morfoloġija, u l-funzjoni huwa għan ewlieni tar-riċerka li għaddejja dwar mard newroloġiku kkaratterizzat minn disfunzjoni mitokondrijali sekondarja.
Tekniki molekulari spiss jintużaw biex jistudjaw ir-rwol ta' ġeni speċifiċi fir-risponsi għall-istress mitokondrijali. Madankollu, dan l-approċċ jista' jkun limitat min-natura multidimensjonali u temporali tal-mekkaniżmi ta' kontroll mitożiku. Barra minn hekk, l-espressjoni differenzjali tal-ġeni mitokondrijali hija indikatur indirett ta' bidliet funzjonali, speċjalment peress li tipikament jiġi analizzat numru limitat biss ta' ġeni. Għalhekk, ġew proposti metodi aktar diretti għall-istudju tal-funzjoni mitokondrijali u l-bijoenerġetika17. Il-morfoloġija mitokondrijali hija relatata mill-qrib mad-dinamika mitokondrijali. Il-forma, il-konnettività u l-istruttura mitokondrijali huma kritiċi għall-produzzjoni tal-enerġija u s-sopravivenza mitokondrijali u taċ-ċelluli5,18. Barra minn hekk, il-komponenti varji tal-mitożi jiffokaw fuq bidliet fil-morfoloġija mitokondrijali, li jistgħu jservu bħala punti finali utli ta' disfunzjoni mitokondrijali u jipprovdu bażi għal studji mekkanistiċi sussegwenti.
Il-morfoloġija mitokondrijali tista' tiġi osservata direttament bl-użu tal-mikroskopija elettronika ta' trasmissjoni (TEM), li tippermetti studju dettaljat tal-ultrastruttura ċellulari. It-TEM jivviżwalizza direttament il-morfoloġija, il-forma u l-istruttura tal-kristae mitokondrijali fir-riżoluzzjoni tal-mitokondrija individwali, aktar milli jiddependi biss fuq it-traskrizzjoni tal-ġeni, l-espressjoni tal-proteini jew il-parametri funzjonali mitokondrijali fil-popolazzjonijiet taċ-ċelloli17,19,20. Barra minn hekk, it-TEM jiffaċilita l-istudju tal-interazzjonijiet bejn il-mitokondrija u organelli oħra, bħar-retikulu endoplasmiku u l-awtofagosomi, li għandhom rwoli ewlenin fil-funzjoni mitokondrijali u l-omeostażi21,22. Għalhekk, dan jagħmel it-TEM punt tat-tluq tajjeb għall-istudju tad-disfunzjoni mitokondrijali qabel ma tiffoka fuq mogħdijiet jew ġeni speċifiċi. Hekk kif il-funzjoni mitokondrijali ssir dejjem aktar rilevanti għan-newropatoloġija, hemm ħtieġa ċara li tkun tista' tistudja direttament u kwantitattivament il-morfoloġija u d-dinamika mitokondrijali f'mudelli newronali in vitro.
F'dan l-artikolu, neżaminaw id-dinamika mitokondrijali f'mudell newronali ta' disfunzjoni mitokondrijali fid-disturb tal-ispettru tal-awtiżmu. Preċedentement irrappurtajna metilazzjoni differenzjali ta' propionyl-CoA carboxylase beta (PCCB) f'ASD15, subunità tal-enzima mitokondrijali propionyl-CoA carboxylase PCC. Id-disregolazzjoni tal-PCC hija magħrufa li tikkawża akkumulazzjoni tossika ta' derivattivi propionyl, inkluż l-aċidu propjoniku (PPA)23,24,25. Il-PPA ntwera li jfixkel il-metaboliżmu newronali u jbiddel l-imġiba in vivo u huwa mudell stabbilit tal-annimali għall-istudju tal-mekkaniżmi newro-żvilupp involuti fl-ASD26,27,28. Barra minn hekk, il-PPA ġie rrappurtat li jfixkel il-potenzjal tal-membrana mitokondrijali, il-bijoġenesi u r-respirazzjoni in vitro u ntuża ħafna biex jimmudella disfunzjoni mitokondrijali fin-newroni29,30. Madankollu, l-impatt tad-disfunzjoni mitokondrijali indotta mill-PPA fuq il-morfoloġija u d-dinamika mitokondrijali għadu mifhum ħażin.
Dan l-istudju juża tekniki ta' immaġini komplementari biex jikkwantifika l-effetti tal-PPA fuq il-morfoloġija, id-dinamika u l-funzjoni mitokondrijali fiċ-ċelloli SH-SY5Y. L-ewwel, żviluppajna metodu TEM biex nivviżwalizzaw il-bidliet fil-morfoloġija u l-ultrastruttura mitokondrijali17,31,32. Minħabba n-natura dinamika tal-mitokondrija33, użajna wkoll analiżi tal-lokalizzatur tal-avvenimenti mitokondrijali (MEL) biex nikkwantifikaw il-bidliet fil-bilanċ bejn l-avvenimenti ta' fissjoni u fużjoni, in-numru u l-volum mitokondrijali taħt stress tal-PPA. Fl-aħħarnett, eżaminajna jekk il-morfoloġija u d-dinamika mitokondrijali humiex assoċjati ma' bidliet fl-espressjoni tal-ġeni involuti fil-bijoġenesi, il-fissjoni u l-fużjoni. Meħuda flimkien, id-dejta tagħna turi l-isfida li tiġi ċċarata l-kumplessità tal-mekkaniżmi li jirregolaw id-dinamika mitokondrijali. Nenfasizzaw l-utilità tat-TEM fl-istudju tal-morfoloġija mitokondrijali bħala endpoint konverġenti li jista' jitkejjel tal-mitożi fiċ-ċelloli SH-SY5Y. Barra minn hekk, nenfasizzaw li d-dejta TEM tipprovdi l-aktar informazzjoni rikka meta kkombinata ma' tekniki ta' immaġini li jaqbdu wkoll avvenimenti dinamiċi b'reazzjoni għall-istress metaboliku. Karatterizzazzjoni ulterjuri tal-mekkaniżmi regolatorji molekulari li jappoġġjaw il-mitożi taċ-ċelluli newronali tista' tipprovdi għarfien importanti dwar il-komponent mitokondrijali tas-sistema nervuża u l-mard newrodeġenerattiv.
Biex jiġi indott stress mitokondrijali, iċ-ċelloli SH-SY5Y ġew ittrattati bil-PPA bl-użu ta' 3 mM u 5 mM sodium propionate (NaP). Qabel it-TEM, il-kampjuni ġew soġġetti għal preparazzjoni krijoġenika ta' kampjuni bl-użu ta' ffriżar bi pressjoni għolja u ffriżar (Fig. 1a). Żviluppajna pipeline awtomatizzat ta' analiżi tal-immaġni mitokondrijali biex inkejlu tmien parametri morfoloġiċi tal-popolazzjonijiet mitokondrijali fi tliet repliki bijoloġiċi. Sibna li t-trattament bil-PPA biddel b'mod sinifikanti erba' parametri: erja 2, erja, perimetru, u dijametru ta' Feret (Fig. 1b–e). Erja 2 naqset b'mod sinifikanti kemm bit-trattament bil-PPA ta' 3 mM kif ukoll b'5 mM (p = 0.0183 u p = 0.002, rispettivament) (Fig. 1b), filwaqt li erja (p = 0.003), perimetru (p = 0.0106) u dijametru ta' Feret kollha naqsu b'mod sinifikanti. Kien hemm tnaqqis sinifikanti (p = 0.0172) fil-grupp ta' trattament ta' 5 mM meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll (Fig. 1c–e). Tnaqqis sinifikanti fiż-żona u ċ-ċirkonferenza wera li ċ-ċelloli ttrattati b'5 mM PPA kellhom mitokondrija iżgħar u aktar fit-tond, u li dawn il-mitokondrija kienu inqas tawwalin minn dawk fiċ-ċelloli ta' kontroll. Dan huwa wkoll konsistenti ma' tnaqqis sinifikanti fid-dijametru ta' Feret, parametru indipendenti li jindika tnaqqis fl-akbar distanza bejn it-truf tal-partiċelli. Ġew osservati bidliet fl-ultrastruttura tal-kristae: il-kristae saru inqas evidenti taħt l-influwenza tal-istress tal-PPA (Fig. 1a, panel B). Madankollu, mhux l-immaġini kollha rriflettew b'mod ċar l-ultrastruttura tal-kristae, għalhekk ma twettqitx analiżi kwantitattiva ta' dawn il-bidliet. Din id-dejta TEM tista' tirrifletti tliet xenarji possibbli: (1) il-PPA ttejjeb il-fissjoni jew tinibixxi l-fużjoni, u tikkawża li l-mitokondrija eżistenti tiċkien fid-daqs; (2) bijoġenesi mtejba toħloq mitokondrija ġdida u iżgħar jew (3) tinduċi ż-żewġ mekkaniżmi simultanjament. Għalkemm dawn il-kundizzjonijiet ma jistgħux jiġu distinti mit-TEM, bidliet morfoloġiċi sinifikanti jindikaw bidliet fl-omeostażi u d-dinamika mitokondrijali taħt l-istress tal-PPA. Sussegwentement esplorajna parametri addizzjonali biex nikkaratterizzaw aktar din id-dinamika u l-mekkaniżmi potenzjali sottostanti.
L-aċidu propjoniku (PPA) jirrimudella l-morfoloġija mitokondrijali. (a) Immaġni rappreżentattivi ta' mikroskopija elettronika ta' trasmissjoni (TEM) li juru li d-daqs mitokondrijali jonqos u l-mitokondrija ssir iżgħar u aktar fit-tond biż-żieda tat-trattament bil-PPA; 0 mM (mhux trattat), 3 mM u 5 mM, rispettivament. Il-vleġeġ ħomor jindikaw il-mitokondrija. (b–e) Ċelloli SH-SY5Y ittrattati bil-PPA għal 24 siegħa tħejjew għat-TEM u r-riżultati ġew analizzati bl-użu ta' Fiji/ImageJ. Erbgħa mit-tmien parametri wrew differenzi sinifikanti bejn iċ-ċelloli ta' kontroll (mhux trattat, 0 mM PPA) u dawk ittrattati (3 mM u 5 mM PPA). (b) Reġjun 2, (c) Żona, (d) Perimetru, (e) Dijametru ta' Feret. Analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda (kontroll vs. trattament) u test ta' tqabbil multiplu ta' Dunnett intużaw biex jiddeterminaw differenzi sinifikanti (p < 0.05). Il-punti tad-dejta jirrappreżentaw il-valur mitokondrijali medju għal kull ċellula individwali, u l-vireg tal-iżball jirrappreżentaw il-medja ± SEM. Id-dejta murija tirrappreżenta n = 3, mill-inqas 24 ċellula għal kull replika; ġew analizzati total ta' 266 immaġni; * jindika p < 0.05, ** jindika p < 0.01.
Biex nikkaratterizzaw aktar kif id-dinamika mitokondrijali tirrispondi għall-PPA, żebgħajna l-mitokondrija bit-tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) u użajna mikroskopija time-lapse u analiżi MEL biex nillokalizzaw u nikkwantifikaw il-mitokondrija wara 24 siegħa fi 3 u 5 mM PPA. Trattament ta' avvenimenti ta' fissjoni u fużjoni. (Fig. 2a). Wara l-analiżi MEL, il-mitokondrija ġiet analizzata aktar biex tikkwantifika n-numru ta' strutturi mitokondrijali u l-volum medju tagħhom. Osservajna żieda żgħira iżda sinifikanti fin-numru ta' avvenimenti ta' fissjoni li seħħew fi 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] meta mqabbla mal-fissjoni [5.6 ± 0.3 (p < 0.05))] u l-avvenimenti ta' fużjoni [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] u fużjoni [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] żdiedu b'mod sinifikanti fi 5 mM meta mqabbla mal-kontroll (Fig. 3b). In-numru ta' mitokondrija żdied b'mod sinifikanti kemm fi 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] kif ukoll fi 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (Fig. 3c), filwaqt li l-volum medju ta' kull struttura mitokondrijali baqa' l-istess (Fig. 3c). 3d). Meħuda flimkien, dan jissuġġerixxi li r-rimudellar tad-dinamika mitokondrijali jservi bħala rispons kompensatorju li jżomm b'suċċess l-integrità tan-netwerk mitokondrijali. Iż-żieda fin-numru ta' avvenimenti ta' fissjoni fi 3 mM PPA tissuġġerixxi li ż-żieda fin-numru mitokondrijali hija parzjalment dovuta għall-fissjoni mitokondrijali, iżda minħabba li l-volum mitokondrijali medju jibqa' essenzjalment l-istess, il-bijoġenesi ma tistax tiġi eskluża bħala rispons kompensatorju addizzjonali. Madankollu, din id-dejta hija konsistenti mal-istrutturi mitokondrijali iżgħar u tondi osservati mit-TEM u turi wkoll bidliet sinifikanti fid-dinamika mitokondrijali indotta mill-PPA.
L-aċidu propjoniku (PPA) jikkaġuna rimodelljar mitokondrijali dinamiku biex iżomm l-integrità tan-netwerk. Iċ-ċelloli SH-SY5Y ġew ikkultivati, ittrattati bi 3 u 5 mM PPA għal 24 siegħa u mtebbgħin b'TMRE u Hoechst 33342 segwiti minn analiżi MEL. (a) Immaġni rappreżentattivi ta' mikroskopija time-lapse li juru l-kulur u projezzjonijiet binarizzati ta' intensità massima fil-ħin 2 (t2) għal kull kundizzjoni. Ir-reġjuni magħżula indikati f'kull immaġni binarja huma mtejba u murija fi 3D fi tliet perjodi ta' żmien differenti (t1-t3) biex juru d-dinamika maż-żmien; l-avvenimenti ta' fużjoni huma enfasizzati bl-aħdar; l-avvenimenti ta' fissjoni huma enfasizzati bl-aħdar. Murija bl-aħmar. (b) Numru medju ta' avvenimenti dinamiċi għal kull kundizzjoni. (c) Numru medju ta' strutturi mitokondrijali għal kull ċellula. (d) Volum medju (µm3) ta' kull struttura mitokondrijali għal kull ċellula. Id-dejta murija hija rappreżentattiva ta' n = 15-il ċellula għal kull grupp ta' trattament. Il-vireg tal-iżbalji murija jirrappreżentaw il-medja ± SEM, il-vireg tal-iskala = 10 μm, * p < 0.05.
L-aċidu propjoniku (PPA) jikkawża soppressjoni traskrizzjonali ta' ġeni assoċjati mad-dinamika mitokondrijali. Iċ-ċelloli SH-SY5Y ġew ittrattati bi 3 u 5 mM PPA għal 24 siegħa. Il-kwantifikazzjoni relattiva tal-ġeni twettqet bl-użu ta' RT-qPCR u ġiet normalizzata għal B2M. Ġeni tal-bijoġenesi mitokondrijali (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 u (d) NFE2L2. Ġeni tal-fużjoni u l-fissjoni mitokondrijali (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 u (i) DRP1. Differenzi sinifikanti (p < 0.05) ġew ittestjati bl-użu ta' ANOVA f'direzzjoni waħda (kontroll vs. trattament) u t-test ta' tqabbil multiplu ta' Dunnett: * jindika p < 0.05, ** jindika p < 0.01, u **** jindika p < 0.0001. Il-vireg jirrappreżentaw l-espressjoni medja ± SEM. Id-dejta murija tirrappreżenta n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), u n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) repliki bijoloġiċi.
Id-dejta mill-analiżijiet TEM u MEL flimkien tindika li l-PPA jibdel il-morfoloġija u d-dinamika mitokondrijali. Madankollu, dawn it-tekniki tal-immaġini ma jipprovdux għarfien dwar il-mekkaniżmi sottostanti li jmexxu dawn il-proċessi. Għalhekk eżaminajna l-espressjoni tal-mRNA ta' disa' regolaturi ewlenin tad-dinamika mitokondrijali, il-bijoġenesi, u l-mitożi b'reazzjoni għat-trattament bil-PPA. Kwantifikajna l-onkoġene tal-mijeloma taċ-ċelluli (cMYC), il-fattur respiratorju nukleari (NRF1), il-fattur ta' traskrizzjoni mitokondrijali 1 (TFAM), il-fattur ta' traskrizzjoni simili għal NFE2 BZIP (NFE2L2), il-proteina simili għal gastrin 2 (STOML2), l-atrofija tan-nerv ottiku 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) u l-proteina relatata mad-dinamina 1 (DRP1) wara 24 siegħa ta' trattament bi 3 mM u 5 mM PPA. Osservajna trattament bil-PPA ta' 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 u p < 0.0001, rispettivament) u 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001). (Fig. 3a–c). It-tnaqqis fl-espressjoni tal-mRNA kien dipendenti mid-doża: l-espressjoni ta' cMYC, NRF1 u TFAM naqset b'5.7, 2.6 u 1.9 darbiet f'3 mM, rispettivament, u b'11.2, 3 u 2.2 darbiet f'5 mM. B'kuntrast, il-ġene ċentrali tal-bijoġenesi redox NFE2L2 ma nbidilx f'xi konċentrazzjoni ta' PPA, għalkemm ġiet osservata xejra simili dipendenti mid-doża ta' tnaqqis fl-espressjoni (Fig. 3d).
Eżaminajna wkoll l-espressjoni tal-ġeni klassiċi involuti fir-regolazzjoni tal-fissjoni u l-fużjoni. STOML2 huwa maħsub li huwa involut fil-fużjoni, il-mitofaġija u l-bijoġenesi, u l-espressjoni tiegħu tnaqqset b'mod sinifikanti (p < 0.0001) bi 3 mM (bidla ta' 2.4 darbiet) u 5 mM (bidla ta' 2.8 darbiet) PPA (Fig. 1). 3d). Bl-istess mod, l-espressjoni tal-ġene tal-fużjoni OPA1 tnaqqset bi 3 mM (bidla ta' 1.6 darbiet) u 5 mM (bidla ta' 1.9 darbiet) PPA (p = 0.006 u p = 0.0024, rispettivament) (Fig. 3f). Madankollu, ma sibniex differenzi sinifikanti fl-espressjoni tal-ġeni tal-fużjoni MFN1, MFN2 jew il-ġene tal-fissjoni DRP1 taħt stress PPA ta' 24 siegħa (Fig. 3g–i). Barra minn hekk, sibna li l-livelli ta' erba' proteini ta' fużjoni u fissjoni (OPA1, MFN1, MFN2 u DRP1) ma nbidlux taħt l-istess kundizzjonijiet (Fig. 4a–d). Huwa importanti li wieħed jinnota li din id-dejta tirrifletti punt wieħed fiż-żmien u tista' ma tirriflettix bidliet fl-espressjoni tal-proteini jew fil-livelli ta' attività matul l-istadji bikrija tal-istress tal-PPA. Madankollu, tnaqqis sinifikanti fl-espressjoni ta' cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, u OPA1 jindika disregolazzjoni traskrizzjonali sinifikanti tal-metaboliżmu mitokondrijali, il-bijoġenesi, u d-dinamika. Barra minn hekk, din id-dejta tenfasizza l-utilità tat-tekniki tal-immaġini biex jiġu studjati direttament bidliet fl-istat finali fil-funzjoni mitokondrijali.
Il-livelli tal-proteini tal-fużjoni u tal-fattur tal-fissjoni ma nbidlux wara t-trattament bl-aċidu propjoniku (PPA). Iċ-ċelloli SH-SY5Y ġew ittrattati bi 3 u 5 mM PPA għal 24 siegħa. Il-livelli tal-proteini ġew kwantifikati permezz ta' analiżi tal-Western blot, u l-livelli ta' espressjoni ġew normalizzati għall-proteina totali. L-espressjoni medja tal-proteini u l-Western blots rappreżentattivi tal-proteina fil-mira u totali huma murija. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Il-vireg jirrappreżentaw il-medja ± SEM, u d-dejta murija hija rappreżentattiva ta' n = 3 repliki bijoloġiċi. Twettqu tqabbil multiplu (p < 0.05) bl-użu ta' analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda u t-test ta' Dunnett. Il-ġell u l-blot oriġinali huma murija fil-Figura S1.
Id-disfunzjoni mitokondrijali hija assoċjata ma' mard multisistemiku li jvarja minn mard metaboliku, kardjovaskulari u muskolari għal mard newroloġiku1,10. Ħafna mard newrodeġenerattiv u newrodeġenerattiv huma assoċjati ma' disfunzjoni mitokondrijali, u dan jenfasizza l-importanza ta' dawn l-organelli matul il-ħajja tal-moħħ. Dawn il-mard jinkludu l-marda ta' Parkinson, il-marda ta' Alzheimer u l-ASD3,4,18. Madankollu, l-aċċess għat-tessut tal-moħħ biex jiġu studjati dawn il-mard huwa diffiċli, speċjalment fil-livell mekkanistiku, u dan jagħmel is-sistemi ta' mudell ċellulari alternattiva neċessarja. F'dan l-istudju, nużaw sistema ta' mudell ċellulari li tuża ċelluli SH-SY5Y ittrattati bil-PPA biex nirrikapitulaw id-disfunzjoni mitokondrijali osservata f'mard newronali, partikolarment disturbi fl-ispettru tal-awtiżmu. L-użu ta' dan il-mudell PPA biex jiġi studjat id-dinamika mitokondrijali fin-newroni jista' jipprovdi għarfien dwar l-etjoloġija tal-ASD.
Esplorajna l-possibbiltà li nużaw it-TEM biex naraw bidliet fil-morfoloġija mitokondrijali. Huwa importanti li wieħed jinnota li t-TEM irid jintuża b'mod korrett biex jiġi massimizzat l-effettività tiegħu. Il-preparazzjoni ta' krijo-kampjuni tippermetti preservazzjoni aħjar tal-istrutturi newronali billi simultanjament tiffissa l-komponenti ċellulari u tnaqqas il-formazzjoni ta' artefatti34. Konsistenti ma' dan, osservajna li ċ-ċelloli SH-SY5Y simili għan-newroni kellhom organelli subċellulari intatti u mitokondrija tawwalija (Fig. 1a). Dan jenfasizza l-utilità tat-tekniki ta' preparazzjoni krijoġenika għall-istudju tal-morfoloġija mitokondrijali f'mudelli ta' ċelloli newronali. Għalkemm il-kejl kwantitattiv huwa kritiku għall-analiżi oġġettiva tad-dejta TEM, għad m'hemm l-ebda kunsens dwar liema parametri speċifiċi għandhom jitkejlu biex jikkonfermaw bidliet morfoloġiċi mitokondrijali. Abbażi ta' numru kbir ta' studji li eżaminaw b'mod kwantitattiv il-morfoloġija mitokondrijali17,31,32, żviluppajna pipeline awtomatizzat ta' analiżi tal-immaġni mitokondrijali li jkejjel tmien parametri morfoloġiċi, jiġifieri: erja, erja2, proporzjon tal-aspett, perimetru, ċirkolarità, grad, dijametru ta' Feret, u tond.
Fost dawn, il-PPA naqqas b'mod sinifikanti l-erja 2, l-erja, il-perimetru, u d-dijametru ta' Feret (Fig. 1b–e). Dan wera li l-mitokondrija saret iżgħar u aktar fit-tond, li huwa konsistenti ma' studji preċedenti li juru tnaqqis fl-erja mitokondrijali wara 72 siegħa ta' stress mitokondrijali indott mill-PPA30. Dawn il-karatteristiċi morfoloġiċi jistgħu jindikaw fissjoni mitokondrijali, proċess neċessarju biex jiġu ssekwestrati l-komponenti bil-ħsara min-netwerk mitokondrijali biex tiġi promossa d-degradazzjoni tagħhom permezz tal-mitofaġija35,36,37. Min-naħa l-oħra, it-tnaqqis fid-daqs mitokondrijali medju jista' jkun assoċjat ma' żieda fil-bijoġenesi, li tirriżulta fil-formazzjoni ta' mitokondrija żgħira li tkun għadha kif bdiet. Żieda fil-fissjoni jew fil-bijoġenesi tirrappreżenta rispons kompensatorju biex tinżamm il-mitożi kontra l-istress mitokondrijali. Madankollu, tnaqqis fit-tkabbir mitokondrijali, fużjoni indebolita, jew kundizzjonijiet oħra ma jistgħux jiġu esklużi.
Għalkemm l-immaġini b'riżoluzzjoni għolja maħluqa mit-TEM jippermettu d-determinazzjoni tal-karatteristiċi morfoloġiċi fil-livell tal-mitokondrija individwali, dan il-metodu jipproduċi snapshots bidimensjonali f'punt wieħed fiż-żmien. Biex nistudjaw ir-risponsi dinamiċi għall-istress metaboliku, żebgħajna l-mitokondrija bit-TMRE u użajna mikroskopija time-lapse b'analiżi MEL, li tippermetti viżwalizzazzjoni 3D b'rendiment għoli tal-bidliet fin-netwerk mitokondrijali maż-żmien33,38. Osservajna bidliet sottili iżda sinifikanti fid-dinamika mitokondrijali taħt stress PPA (Fig. 2). Fi 3 mM, in-numru ta' avvenimenti ta' fissjoni żdied b'mod sinifikanti, filwaqt li l-avvenimenti ta' fużjoni baqgħu l-istess bħal fil-kontroll. Żieda fin-numru kemm ta' avvenimenti ta' fissjoni kif ukoll ta' fużjoni ġiet osservata fi 5 mM PPA, iżda dawn il-bidliet kienu bejn wieħed u ieħor proporzjonali, li jissuġġerixxi li l-kinetika tal-fissjoni u l-fużjoni tilħaq ekwilibriju f'konċentrazzjonijiet ogħla (Fig. 2b). Il-volum mitokondrijali medju baqa' l-istess kemm fi 3 kif ukoll f'5 mM PPA, li jindika li l-integrità tan-netwerk mitokondrijali ġiet ippreservata (Fig. 2d). Dan jirrifletti l-abbiltà tan-netwerks mitokondrijali dinamiċi li jirrispondu għal stress metaboliku ħafif biex iżommu l-omeostażi b'mod effettiv mingħajr ma jikkawżaw frammentazzjoni tan-netwerk. Fi 3 mM PPA, iż-żieda fil-fissjoni hija biżżejjed biex tippromwovi t-tranżizzjoni għal ekwilibriju ġdid, iżda huwa meħtieġ rimudellar kinetiku aktar profond b'reazzjoni għall-istress ikkaġunat minn konċentrazzjonijiet ogħla ta' PPA.
L-għadd ta' mitokondrija żdied fiż-żewġ konċentrazzjonijiet ta' stress tal-PPA, iżda l-volum mitokondrijali medju ma nbidilx b'mod sinifikanti (Fig. 2c). Dan jista' jkun minħabba żieda fil-bijoġenesi jew żieda fid-diviżjoni; madankollu, fin-nuqqas ta' tnaqqis sinifikanti fil-volum mitokondrijali medju, huwa aktar probabbli li l-bijosintesi tiżdied. Madankollu, id-dejta fil-Figura 2 tappoġġja l-eżistenza ta' żewġ mekkaniżmi kompensatorji: żieda fl-għadd ta' avvenimenti ta' fissjoni, konsistenti ma' żieda fil-fissjoni mitokondrijali, u żieda fl-għadd ta' avvenimenti, konsistenti mal-bijoġenesi mitokondrijali. Fl-aħħar mill-aħħar, il-kumpens dinamiku għal stress ħafif jista' jikkonsisti fi proċessi simultanji li jinvolvu l-fissjoni, il-fużjoni, il-bijoġenesi, u l-mitofaġija. Għalkemm awturi preċedenti wrew li l-PPA jtejjeb il-mitożi30,39 u l-mitofaġija29, aħna nipprovdu evidenza għar-rimudellar tad-dinamika tal-fissjoni u l-fużjoni mitokondrijali b'reazzjoni għall-PPA. Din id-dejta tikkonferma l-bidliet morfoloġiċi osservati mit-TEM u tipprovdi aktar għarfien dwar il-mekkaniżmi assoċjati mad-disfunzjoni mitokondrijali indotta mill-PPA.
Peress li la l-analiżi TEM u lanqas l-analiżi MEL ma pprovdew evidenza diretta tal-mekkaniżmi regolatorji tal-ġeni li fuqhom huma bbażati l-bidliet morfoloġiċi osservati, eżaminajna l-espressjoni tal-RNA tal-ġeni involuti fil-metaboliżmu mitokondrijali, il-bijoġenesi u d-dinamika. Il-proto-onkoġene cMYC huwa fattur ta' traskrizzjoni involut fir-regolazzjoni tal-mitokondrija, il-glikoliżi, il-metaboliżmu tal-aċidi amminiċi u l-aċidi grassi40. Barra minn hekk, is-cMYC huwa magħruf li jirregola l-espressjoni ta' kważi 600 ġene mitokondrijali involuti fit-traskrizzjoni mitokondrijali, it-traduzzjoni u l-assemblaġġ kumpless, inklużi NRF1 u TFAM41. NRF1 u TFAM huma żewġ regolaturi ċentrali tal-mitożi, li jaġixxu 'l isfel minn PGC-1α biex jattivaw ir-replikazzjoni tal-mtDNA. Din il-mogħdija hija attivata mis-sinjalar tas-cAMP u l-AMPK u hija sensittiva għall-infiq tal-enerġija u l-istress metaboliku. Eżaminajna wkoll NFE2L2, regolatur redox tal-bijoġenesi mitokondrijali, biex niddeterminaw jekk l-effetti tal-PPA jistgħux ikunu medjati minn stress ossidattiv.
Għalkemm l-espressjoni ta' NFE2L2 baqgħet l-istess, sibna tnaqqis konsistenti dipendenti mid-doża fl-espressjoni ta' cMYC, NRF1 u TFAM wara 24 siegħa ta' trattament bi 3 mM u 5 mM PPA (Fig. 3a–c). It-tnaqqis fl-espressjoni ta' cMYC ġie rrappurtat qabel bħala rispons għall-istress mitokondrijali42, u bil-maqlub, it-tnaqqis fl-espressjoni ta' cMYC jista' jikkawża disfunzjoni mitokondrijali billi jimmudella mill-ġdid il-metaboliżmu mitokondrijali, il-konnettività tan-netwerk, u l-polarizzazzjoni tal-membrana43. Interessanti, cMYC huwa involut ukoll fir-regolazzjoni tal-fissjoni u l-fużjoni mitokondrijali42,43 u huwa magħruf li jżid il-fosforilazzjoni tad-DRP1 u l-lokalizzazzjoni mitokondrijali waqt id-diviżjoni taċ-ċelluli44, kif ukoll jimmedja r-rimudellar morfoloġiku mitokondrijali fiċ-ċelluli staminali newronali45. Tabilħaqq, fibroblasti defiċjenti fis-cMYC juru daqs mitokondrijali mnaqqas, konsistenti mal-bidliet ikkaġunati mill-istress tal-PPA43. Din id-dejta turi relazzjoni interessanti iżda għadha mhux ċara bejn is-cMYC u d-dinamika mitokondrijali, u tipprovdi mira interessanti għal studji futuri dwar ir-rimudellar ikkaġunat mill-istress tal-PPA.
It-tnaqqis ta' NRF1 u TFAM huwa konsistenti mar-rwol ta' cMYC bħala attivatur traskrizzjonali importanti. Din id-dejta hija wkoll konsistenti ma' studji preċedenti f'ċelloli tal-kanċer tal-kolon uman li juru li l-PPA naqqas l-espressjoni tal-mRNA ta' NRF1 fi 22 siegħa, li kien assoċjat mat-tnaqqis tal-ATP u żied l-ROS46. Dawn l-awturi rrappurtaw ukoll li l-espressjoni ta' TFAM żdiedet fi 8.5 sigħat iżda rritornat għal-livelli bażi fi 22 siegħa. B'kuntrast, Kim et al. (2019) urew li l-espressjoni tal-mRNA ta' TFAM naqset b'mod sinifikanti wara 4 sigħat ta' stress tal-PPA f'ċelloli SH-SY5Y; madankollu, wara 72 siegħa, l-espressjoni tal-proteina TFAM żdiedet b'mod sinifikanti u n-numru ta' kopji tal-mtDNA żdied b'mod sinifikanti. Għalhekk, it-tnaqqis fin-numru ta' ġeni tal-bijoġenesi mitokondrijali li osservajna wara 24 siegħa ma jeskludix il-possibbiltà li ż-żieda fin-numru ta' mitokondrija hija assoċjata mal-attivazzjoni tal-bijoġenesi f'punti ta' żmien aktar bikrija. Studji preċedenti wrew li l-PPA jżid b'mod sinifikanti l-mRNA u l-proteina tal-PGC-1α fiċ-ċelloli SH-SY5Y f'4 sigħat u 30 minuta, filwaqt li l-aċidu propjoniku jtejjeb il-bijoġenesi mitokondrijali fl-epatoċiti tal-għoġol permezz tal-PGC-1α fi 12-il siegħa u 39 minuta. Interessanti, il-PGC-1α mhux biss huwa regolatur traskrizzjonali dirett ta' NRF1 u TFAM, iżda ntwera wkoll li jirregola l-attività ta' MFN2 u DRP1 billi jirregola l-fissjoni u l-fużjoni47. Meħuda flimkien, dan jenfasizza l-akkoppjar mill-qrib ta' mekkaniżmi li jirregolaw ir-risponsi kompensatorji mitokondrijali kkaġunati mill-PPA. Barra minn hekk, id-dejta tagħna tirrifletti disregolazzjoni sinifikanti tar-regolazzjoni traskrizzjonali tal-bijoġenesi u l-metaboliżmu taħt stress tal-PPA.
Il-ġeni STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 u DRP1 huma fost ir-regolaturi ċentrali tal-fissjoni, il-fużjoni u d-dinamika mitokondrijali37,48,49. Hemm ħafna ġeni oħra involuti fid-dinamika mitokondrijali, madankollu, STOML2, OPA1 u MFN2 instabu qabel li huma metilati b'mod differenzjali f'koorti ASD,16 u diversi studji indipendenti rrappurtaw bidliet f'dawn il-fatturi ta' traskrizzjoni b'reazzjoni għall-istress mitokondrijali50,51.52. L-espressjoni kemm ta' OPA1 kif ukoll ta' STOML2 tnaqqset b'mod sinifikanti bi trattament PPA ta' 3 mM u 5 mM (Fig. 3e, f). OPA1 huwa wieħed mir-regolaturi klassiċi tal-fużjoni mitokondrijali permezz ta' interazzjoni diretta ma' MFN1 u 2 u għandu rwol fir-rimudellar tal-kristae u l-morfoloġija mitokondrijali53. Ir-rwol preċiż ta' STOML2 fid-dinamika mitokondrijali għadu mhux ċar, iżda l-evidenza tissuġġerixxi li għandu rwol fil-fużjoni mitokondrijali, il-bijoġenesi u l-mitofaġija.
STOML2 huwa involut fiż-żamma tal-akkoppjar respiratorju mitokondrijali u l-formazzjoni ta' kumplessi tal-katina respiratorja54,55 u ntwera li jbiddel profondament il-karatteristiċi metaboliċi taċ-ċelloli tal-kanċer56. Studji wrew li STOML2 jippromwovi l-potenzjal tal-membrana mitokondrijali u l-bijoġenesi permezz ta' interazzjoni ma' BAN u kardjolipina 55, 57, 58. Barra minn hekk, studji indipendenti wrew li l-interazzjoni bejn STOML2 u PINK1 tirregola l-mitofaġija59,60. Notevolment, ġie rrappurtat li STOML2 jinteraġixxi direttament ma' u jistabbilizza MFN2 u għandu wkoll rwol importanti fl-istabbilizzazzjoni ta' isoformi twal ta' OPA1 billi jinibixxi l-protease responsabbli għad-degradazzjoni ta' OPA153,61,62. It-tnaqqis fl-espressjoni ta' STOML2 osservat fir-reazzjonijiet tal-PPA jista' jagħmel dawn il-proteini tal-fużjoni aktar suxxettibbli għad-degradazzjoni permezz ta' mogħdijiet dipendenti fuq l-ubiquitin u l-proteasoma48. Għalkemm ir-rwol preċiż ta' STOML2 u OPA1 fir-rispons dinamiku għall-PPA mhux ċar, tnaqqis fl-espressjoni ta' dawn il-ġeni tal-fużjoni (Figura 3) jista' jfixkel il-bilanċ bejn il-fissjoni u l-fużjoni u jwassal għal tnaqqis fid-daqs mitokondrijali (Figura 3). 1).
Min-naħa l-oħra, l-espressjoni tal-proteina OPA1 baqgħet l-istess wara 24 siegħa, filwaqt li l-livelli ta' mRNA u proteini ta' MFN1, MFN2 jew DRP1 ma nbidlux b'mod sinifikanti wara t-trattament bil-PPA (Fig. 3g-i, Fig. 4). Dan jista' jindika li m'hemm l-ebda tibdil fir-regolazzjoni ta' dawn il-fatturi involuti fil-fużjoni u l-fissjoni mitokondrijali. Madankollu, ta' min jinnota li kull wieħed minn dawn l-erba' ġeni huwa regolat ukoll minn modifiki post-traskrizzjonali (PTMs) li jikkontrollaw l-attività tal-proteini. OPA1 għandu tmien varjanti alternattivi ta' splicing li huma maqsuma proteolitikament fil-mitokondrija biex jipproduċu żewġ isoformi distinti 63. Il-bilanċ bejn isoformi twal u qosra fl-aħħar mill-aħħar jiddetermina r-rwol ta' OPA1 fil-fużjoni mitokondrijali u l-manutenzjoni tan-netwerk mitokondrijali 64. L-attività ta' DRP1 hija regolata mill-fosforilazzjoni tal-proteina kinase II dipendenti fuq il-kalċju/kalmodulina (CaMKII), filwaqt li d-degradazzjoni ta' DRP1 hija regolata mill-ubikwitinazzjoni u s-SUMOylation 65. Fl-aħħar nett, kemm DRP1 kif ukoll MFN1/2 huma GTPases, għalhekk l-attività tista' tkun influwenzata mir-rata tal-produzzjoni tal-GTP fil-mitokondrija 66. Għalhekk, għalkemm l-espressjoni ta' dawn il-proteini tibqa' kostanti, dan jista' ma jirriflettix attività jew lokalizzazzjoni tal-proteini mhux mibdula 67,68. Tabilħaqq, ir-repertorji eżistenti tal-proteini PTM spiss iservu bħala l-ewwel linja ta' difiża responsabbli għall-medjazzjoni tar-risponsi għall-istress akut. Fil-preżenza ta' stress metaboliku moderat fil-mudell tagħna, x'aktarx li l-PTM jippromwovi żieda fl-attività tal-proteini tal-fużjoni u l-fissjoni biex jirrestawra b'mod suffiċjenti l-integrità mitokondrijali mingħajr ma jkun hemm bżonn ta' attivazzjoni addizzjonali ta' dawn il-ġeni fil-livell tal-mRNA jew tal-proteina.
Meħuda flimkien, id-dejta ta' hawn fuq tenfasizza r-regolazzjoni kumplessa u dipendenti fuq il-ħin tal-morfoloġija mitokondrijali u l-isfidi biex jiġu eluċidati dawn il-mekkaniżmi. Biex tiġi studjata l-espressjoni tal-ġeni, l-ewwel huwa meħtieġ li jiġu identifikati ġeni fil-mira speċifiċi fil-mogħdija. Madankollu, id-dejta tagħna turi li l-ġeni fl-istess mogħdija ma jirrispondux bl-istess mod għall-istess stress. Fil-fatt, studji preċedenti wrew li ġeni differenti fl-istess mogħdija jistgħu juru profili ta' rispons temporali differenti30,46. Barra minn hekk, hemm mekkaniżmi kumplessi ta' wara t-traskrizzjoni li jfixklu r-relazzjoni bejn it-traskrizzjoni u l-funzjoni tal-ġeni. Studji proteomiċi jistgħu jipprovdu għarfien dwar l-impatt tal-PTMs u l-funzjoni tal-proteini, iżda joħolqu wkoll sfidi inklużi metodi ta' rendiment baxx, proporzjonijiet għoljin ta' sinjal għal ħoss, u riżoluzzjoni fqira.
F'dan il-kuntest, l-istudju tal-morfoloġija mitokondrijali bl-użu tat-TEM u l-MEL għandu potenzjal kbir biex jindirizza mistoqsijiet fundamentali dwar ir-relazzjoni bejn id-dinamika u l-funzjoni mitokondrijali u kif dan jinfluwenza l-marda. L-aktar importanti, it-TEM jipprovdi metodu dirett għall-kejl tal-morfoloġija mitokondrijali bħala endpoint konverġenti tad-disfunzjoni u d-dinamika mitokondrijali51. L-MEL jipprovdi wkoll metodu dirett għall-viżwalizzazzjoni ta' avvenimenti ta' fissjoni u fużjoni f'ambjent ċellulari tridimensjonali, li jippermetti kwantifikazzjoni tar-rimudellar mitokondrijali dinamiku anke fin-nuqqas ta' bidliet fl-espressjoni tal-ġeni33. Hawnhekk nenfasizzaw l-utilità tat-tekniki tal-immaġini mitokondrijali f'mard mitokondrijali sekondarju. Dawn il-mard huma tipikament ikkaratterizzati minn stress metaboliku ħafif kroniku kkaratterizzat minn rimudellar sottili tan-netwerks mitokondrijali aktar milli ħsara mitokondrijali akuta. Madankollu, il-kumpens mitokondrijali meħtieġ biex tinżamm il-mitożi taħt stress kroniku għandu konsegwenzi funzjonali profondi. Fil-kuntest tan-newroxjenza, fehim aħjar ta' dawn il-mekkaniżmi kompensatorji jista' jipprovdi informazzjoni importanti dwar in-newropatoloġija plejotropika assoċjata mad-disfunzjoni mitokondrijali.
Fl-aħħar mill-aħħar, id-dejta tagħna tenfasizza l-utilità tat-tekniki tal-immaġini biex nifhmu l-konsegwenzi funzjonali tal-interazzjonijiet kumplessi bejn l-espressjoni tal-ġeni, il-modifiki tal-proteini, u l-attività tal-proteini li jikkontrollaw id-dinamika mitokondrijali newronali. Użajna l-PPA biex nimmudellaw id-disfunzjoni mitokondrijali f'mudell ta' ċellula newronali biex niksbu għarfien dwar il-komponent mitokondrijali tal-ASD. Iċ-ċelloli SH-SY5Y ittrattati bil-PPA wrew bidliet fil-morfoloġija mitokondrijali: il-mitokondrija saret żgħira u tonda, u l-kristae ma kinux definiti sew meta osservati permezz tat-TEM. L-analiżi tal-MEL turi li dawn il-bidliet iseħħu flimkien ma' żieda fl-avvenimenti ta' fissjoni u fużjoni biex tinżamm in-netwerk mitokondrijali b'reazzjoni għal stress metaboliku ħafif. Barra minn hekk, il-PPA jfixkel b'mod sinifikanti r-regolazzjoni traskrizzjonali tal-metaboliżmu mitokondrijali u l-omeostażi. Identifikajna cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, u OPA1 bħala regolaturi mitokondrijali ewlenin imfixkla mill-istress tal-PPA u jistgħu jkollhom rwol fil-medjazzjoni tal-bidliet indotti mill-PPA fil-morfoloġija u l-funzjoni mitokondrijali. Huma meħtieġa studji futuri biex jiġu kkaratterizzati aħjar il-bidliet temporali indotti mill-PPA fl-espressjoni tal-ġeni u l-attività tal-proteini, il-lokalizzazzjoni, u l-modifiki wara t-traduzzjoni. Id-dejta tagħna tenfasizza l-kumplessità u l-interdipendenza tal-mekkaniżmi regolatorji li jimmedjaw ir-rispons għall-istress mitokondrijali u turi l-utilità tat-TEM u tekniki oħra tal-immaġini għal studji mekkanistiċi aktar immirati.
Il-linja taċ-ċelluli SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) inxtrat mingħand Sigma-Aldrich. Iċ-ċelluli SH-SY5Y tkabbru f'taħlita ta' nutrijenti Dulbecco's modified Eagle's medium/F-12 (DMEM/F-12) u L-glutamine (SC09411, ScienCell) fi fliexken ta' 25 cm2 supplimentati b'20% serum bovin fetali (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) u 1% peniċillina-streptomycin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) f'temperatura ta' 37 °C, 5% CO2. Iċ-ċelluli ġew sottokultivati ​​għal 80% konfluwenza bl-użu ta' 0.05% trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), ċentrifugati fi 300 g u mqiegħda f'densità ta' madwar 7 × 105 ċelluli/ml. L-esperimenti kollha twettqu fuq ċelluli SH-SY5Y mhux differenzjati bejn il-passaġġi 19–22. Il-PPA jingħata bħala NaP. Dewweb it-trab NaP (CAS Nru. 137-40-6, formula kimika C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) f'ilma sħun MilliQ għal konċentrazzjoni ta' 1 M u aħżen f'4 °C. Fil-jum tat-trattament, iddilwixxi din is-soluzzjoni b'1 M PPA għal 3 mM u 5 mM PPA f'mezz ħieles mis-serum (DMEM/F-12 b'L-glutamina). Il-konċentrazzjonijiet tat-trattament għall-esperimenti kollha kienu mingħajr PPA (0 mM, kontroll), 3 mM, u 5 mM PPA. L-esperimenti twettqu f'mill-inqas tliet repliki bijoloġiċi.
Iċ-ċelloli SH-SY5Y ġew miżrugħa fi fliexken ta' 25 cm5 b'rata ta' 5.5 × 105 ċelloli/ml u mkabbra għal 24 siegħa. It-trattament bil-PPA ġie miżjud mal-flask qabel 24 siegħa ta' inkubazzjoni. Iġbor il-gerbub taċ-ċelloli wara l-protokolli normali ta' subkultura tat-tessut tal-mammiferi (deskritti hawn fuq). Issospendi mill-ġdid il-gerbub taċ-ċelloli f'100 µl ta' 2.5% glutaraldehyde, 1× PBS u aħżen f'4 °C sakemm jiġi pproċessat. Iċ-ċelloli SH-SY5Y ġew ċentrifugati fil-qosor biex iċ-ċelloli jiġu gerbuba u titneħħa s-soluzzjoni ta' 2.5% glutaraldehyde, 1× PBS. Issospendi mill-ġdid is-sediment f'ġel ta' 4% agarose ppreparat f'ilma distillat (il-proporzjon tal-agarose għall-volum tas-sediment huwa 1:1). Il-biċċiet tal-agarose tqiegħdu fuq gradilji fuq pjanċi ċatti u ġew miksija b'1-hexadecene qabel l-iffriżar bi pressjoni għolja. Il-kampjuni ġew iffriżati f'100% aċetun niexef f'-90°C għal 24 siegħa. It-temperatura mbagħad żdiedet għal -80°C u ġiet miżjuda soluzzjoni ta' 1% osmium tetroxide u 0.1% glutaraldehyde. Il-kampjuni nħażnu f'-80°C għal 24 siegħa. Wara dan, it-temperatura żdiedet gradwalment għat-temperatura tal-kamra fuq diversi jiem: minn – 80 °C għal – 50 °C għal 24 siegħa, għal – 30 °C għal 24 siegħa, għal – 10 °C għal 24 siegħa u finalment għat-temperatura tal-kamra.
Wara l-preparazzjoni krijoġenika, il-kampjuni ġew mimlija bir-reżina u saru sezzjonijiet ultrarqaq (∼100 nm) bl-użu ta' ultramikrotomu Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Is-sezzjonijiet ġew imtebbgħin b'2% uranyl acetate u lead citrate. Il-kampjuni ġew osservati bl-użu ta' mikroskopju elettroniku ta' trasmissjoni FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (li qabel kien FEI), Eindhoven, l-Olanda) li jopera f'200 kV (trasmettitur Lab6) u kamera Gatan CCD (Gatan, UK) mgħammra b'filtru tal-enerġija Tridiem.
F'kull replika teknika, inkisbu mill-inqas 24 immaġni ta' ċellula waħda, għal total ta' 266 immaġni. L-immaġnijiet kollha ġew analizzati bl-użu tal-makro tar-Reġjun ta' Interess (ROI) u l-makro tal-Mitokondrija. Il-makro mitokondrijali huwa bbażat fuq metodi ppubblikati17,31,32 u jippermetti l-ipproċessar semi-awtomatiku tal-lottijiet ta' immaġnijiet TEM f'Fiji/ImageJ69. Fil-qosor: l-immaġni hija maqluba u maqluba bl-użu tat-tnaqqis tal-isfond tal-ballun irrumblat (raġġ ta' 60 pixel) u filtru bandpass FFT (bl-użu ta' limiti ta' fuq u ta' isfel ta' 60 u 8 pixel rispettivament) u soppressjoni tal-linja vertikali b'tolleranza ta' orjentazzjoni ta' 5%. L-immaġni pproċessata hija awtomatikament limitata bl-użu ta' algoritmu ta' entropija massima u tiġi ġġenerata maskra binarja. Ir-reġjuni tal-immaġni assoċjati ma' ROIs magħżula manwalment f'immaġnijiet TEM mhux ipproċessati ġew estratti, li kkaratterizzaw il-mitokondrija u esklużew il-membrana tal-plażma u reġjuni oħra b'kuntrast għoli. Għal kull ROI estratt, ġew analizzati partiċelli binarji akbar minn 600 pixel, u l-erja tal-partiċelli, il-perimetru, l-assi maġġuri u minuri, id-dijametru ta' Feret, it-tondità, u ċ-ċirkolarità tkejlu bl-użu tal-funzjonijiet ta' kejl integrati ta' Fiji/ImageJ. Skont Merrill, Flippo, u Strack (2017), l-erja 2, il-proporzjon tal-aspett tal-partiċelli (proporzjon tal-assi maġġuri għall-assi minuri), u l-fattur tal-forma (FF) ġew ikkalkulati minn din id-dejta, fejn FF = perimetru 2/4pi x erja. Id-definizzjoni tal-formula parametrika tista' tinstab f'Merrill, Flippo, u Strack (2017). Il-makros imsemmija huma disponibbli fuq GitHub (ara d-Dikjarazzjoni tad-Disponibbiltà tad-Dejta). Bħala medja, ġew analizzati madwar 5,600 partiċella għal kull trattament PPA, għal total ta' madwar 17,000 partiċella (dejta mhux murija).
Iċ-ċelloli SH-SH5Y tqiegħdu fi platti tal-kultura bi 8 kmamar (ThermoFisher, #155411) biex jippermettu adeżjoni matul il-lejl u mbagħad inkubati b'TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) u Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). L-immaġnijiet inkisbu bl-użu ta' lejżers ta' 405 nm u 561 nm fuq ambjent ta' 10 minuti, u l-immaġnijiet mhux ipproċessati nkisbu bħala z-stacks li fihom 10 mikrografi tal-immaġni b'pass az ta' 0.2 μm bejn il-frejms tal-immaġni fi 12-il punt ta' ħin sussegwenti. L-immaġnijiet inġabru bl-użu ta' pjattaforma ta' super-riżoluzzjoni Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, il-Ġermanja) bl-użu ta' lenti LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. L-immaġini ġew analizzati f'ImageJ bl-użu ta' pipeline deskritt qabel u l-plugin ImageJ biex jitkejlu l-avvenimenti ta' fużjoni u fissjoni, in-numru medju ta' strutturi mitokondrijali, u l-volum mitokondrijali medju għal kull ċellula33. Il-makros tal-MEL huma disponibbli fuq GitHub (ara d-Dikjarazzjoni tad-Disponibbiltà tad-Data).
Iċ-ċelloli SH-SY5Y tkabbru fi pjanċi ta’ sitt bjar b’densità ta’ 0.3 × 106 ċelloli/mL għal 24 siegħa qabel it-trattament. L-RNA ġie estratt bl-użu tal-protokoll Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) b’modifiki żgħar: żid 300 μl ta’ buffer tal-liżi tal-RNA ma’ kull bjar qabel it-tneħħija u liża kull kampjun bħala l-pass finali bi 30 μl ta’ eluzzjoni DNase/RNase. ilma ħieles. Il-kampjuni kollha ġew iċċekkjati għall-kwantità u l-kwalità bl-użu ta’ Spettrofotometru UV-Vis NanoDrop ND-1000. Il-proteina totali mil-lisati taċ-ċelloli nkisbet bl-użu ta’ 200 μl ta’ buffer tal-liżi RIPA, u l-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet kwantifikata bl-użu tal-assaġġ tal-proteini Bradford70.
Is-sintesi tas-cDNA twettqet bl-użu tat-Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur b'xi modifiki. Is-cDNA ġie sintetizzat f'reazzjonijiet ta' 20 μl bl-użu ta' 0.7 sa 1 μg ta' RNA totali. Il-primers intgħażlu minn dokumenti ppubblikati qabel 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabella S1) u s-sondi li jakkumpanjawhom ġew iddisinjati bl-użu tal-għodda PrimerQuest minn Integrated DNA Technologies. Il-ġeni kollha ta' interess ġew normalizzati għall-ġene nukleari B2M. L-espressjoni tal-ġeni ta' STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC u OPA1 tkejlet permezz ta' RT-qPCR. It-taħlita ewlenija inkludiet LUNA Taq polymerase (M3003L, New England Biolabs), 10 μM primers 'il quddiem u lura, cDNA, u ilma ta' grad PCR biex tagħti volum finali ta' 10 μL għal kull reazzjoni. L-espressjoni tal-ġeni tad-diviżjoni u l-fissjoni (DRP1, MFN1/2) tkejlet bl-użu ta' assays multiplex TaqMan. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) intużat skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur b'modifiki żgħar. It-taħlita ewlenija multiplex RT-qPCR tinkludi 1X LUNA Taq polymerase, 10 μM primers 'il quddiem u lura, 10 μM probe, cDNA, u ilma ta' grad PCR, li rriżulta f'volum finali ta' 20 μL għal kull reazzjoni. RT-qPCR twettqet bl-użu ta' Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—numru tas-serje: R0618110). Il-kundizzjonijiet taċ-ċikliżmu huma murija fit-Tabella S1. Il-kampjuni kollha tas-cDNA ġew amplifikati fi triplikat u ġiet iġġenerata kurva standard bl-użu ta' serje ta' dilwizzjonijiet ta' għaxar darbiet. Valuri anomali f'kampjuni triplikati b'devjazzjoni standard tal-limitu taċ-ċiklu (Ct) >0.5 tneħħew mill-analiżi biex tiġi żgurata r-riproduċibbiltà tad-dejta30,72. L-espressjoni relattiva tal-ġeni ġiet ikkalkulata bl-użu tal-metodu 2-ΔΔCt79.
Kampjuni ta' proteini (60 μg) tħalltu ma' Laemmli loading buffer fi proporzjon ta' 2:1 u tħaddmu fuq ġel ta' proteini bla kulur ta' 12% (Bio-Rad #1610184). Il-proteini ġew trasferiti għal membrana PVDF (polyvinylidene fluoride) (#170-84156, Bio-Rad) bl-użu tas-sistema Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Il-membrana ġiet imblukkata u inkubata bl-antikorpi primarji xierqa (OPA1, MFN1, MFN2, u DRP1) (dilwiti 1:1000) għal 48 siegħa, segwita minn inkubazzjoni b'antikorpi sekondarji (1:10,000) għal siegħa. Il-membrani mbagħad ġew immaġinati bl-użu ta' Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) u rreġistrati bl-użu ta' sistema Bio-Rad ChemiDoc MP. ImageLab verżjoni 6.1 intużat għall-analiżi tal-Western blot. Il-ġel u l-blot oriġinali huma murija fil-Figura S1. Informazzjoni dwar l-antikorpi hija pprovduta fit-Tabella S2.
Is-settijiet tad-dejta huma ppreżentati bħala l-medja u l-iżball standard tal-medja (SEM) ta' mill-inqas tliet kampjuni indipendenti. Is-settijiet tad-dejta ġew ittestjati għan-normalità bl-użu tat-test Shapiro-Wilks (sakemm ma jkunx iddikjarat mod ieħor) qabel ma ġiet assunta distribuzzjoni Gaussjana u devjazzjonijiet standard ugwali u qabel ma pproċediet bl-analiżi. Minbarra l-analiżi tas-sett tad-dejta bl-użu tal-MEL LSD ta' Fisher (p < 0.05), ANOVA f'direzzjoni waħda (medja ta' trattament vs. kontroll), u t-test ta' tqabbil multiplu ta' Dunnett biex tiġi ddeterminata s-sinifikat (p < 0.05). Valuri p sinifikanti huma murija fil-graff bħala *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. L-analiżijiet statistiċi u l-graffs kollha twettqu u ġew iġġenerati bl-użu tal-GraphPad Prism 9.4.0.
Makros Fiji/ImageJ għall-analiżi tal-immaġni TEM huma disponibbli pubblikament fuq GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Il-makro Mitochondrial Event Locator (MEL) huwa disponibbli pubblikament fuq GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM u Vijaya A. Mitokondrija: regolaturi ewlenin tal-metaboliżmu, l-omeostażi, l-istress, it-tixjiħ u l-epiġenetika. Indoneżjan. Xjenza Bijomedika. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Disfunzjoni mitokondrijali b'ħafna aspetti fl-iskizofrenija, kumpless I bħala mira patoloġika possibbli. Skizofrenija. riżorsa. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. u Beal, MF Disfunzjoni mitokondrijali fil-marda ta' Parkinson. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG u Mehta V. Mitokondrija stressata: miri ta' invażjoni fil-marda ta' Alzheimer. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF u Ferreira GK Il-mitokondrija u l-moħħ: bijoenerġetika u aktar. Newrotossini. riżorsa. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Mitokondrija plejotropika: l-impatt tal-mitokondrija fuq l-iżvilupp u l-mard newronali. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. u Morais, VA Bijoġenesi mitokondrijali fin-newroni: kif u fejn. Internazzjonalità. J. Mohr. Ix-Xjenza. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. u Zhao, J. Regolazzjoni tad-dinamika mitokondrijali tal-mammiferi: opportunitajiet u sfidi. front. endokrinali. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. u Slack, RS Dinamika mitokondrijali fir-regolazzjoni tan-newroġenesi: mill-moħħ li qed jiżviluppa għal dak adult. żvilupp. dinamika. 247, 47–53 (2018).