L-artiklu huwa parti mis-suġġett tar-riċerka “It-titjib tar-reżistenza tal-legumi għall-patoġeni u l-pesti”, ara l-5 artikli kollha
L-aġent kawżali tan-nekrożi tal-marda fungali tal-pjanti Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary juża strateġija b'ħafna livelli biex jinfetta pjanti ospitanti differenti. Dan l-istudju jipproponi l-użu tad-diamine L-ornithine, aċidu amminiku mhux proteiku li jistimula s-sintesi ta' aċidi amminiċi essenzjali oħra, bħala strateġija ta' ġestjoni alternattiva biex ittejjeb ir-risponsi molekulari, fiżjoloġiċi u bijokimiċi ta' Phaseolus vulgaris L. għall-moffa bajda kkawżata minn Pseudomonas sclerotiorum. Esperimenti in vitro wrew li L-ornithine inibixxa b'mod sinifikanti t-tkabbir miċeljali ta' S. pyrenoidosa b'mod dipendenti mid-doża. Barra minn hekk, jista' jnaqqas b'mod sinifikanti s-severità tal-moffa bajda f'kundizzjonijiet ta' serra. Barra minn hekk, L-ornithine stimula t-tkabbir tal-pjanti ttrattati, u dan jindika li l-konċentrazzjonijiet ittestjati ta' L-ornithine ma kinux fitotossiċi għall-pjanti ttrattati. Barra minn hekk, L-ornithine tejjeb l-espressjoni ta' antiossidanti mhux enżimatiċi (fenoliċi u flavonoids solubbli totali) u antiossidanti enżimatiċi (catalase (CAT), peroxidase (POX), u polyphenol oxidase (PPO)), u żied l-espressjoni ta' tliet ġeni relatati mal-antiossidanti (PvCAT1, PvSOD, u PvGR). Barra minn hekk, l-analiżi in silico żvelat il-preżenza ta' proteina putattiva oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) fil-ġenoma ta' S. sclerotiorum, li kienet simili ħafna għall-proteini oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) ta' Aspergillus fijiensis (AfOAH) u Penicillium sp. (PlOAH) f'termini ta' analiżi funzjonali, dominji konservati, u topoloġija. Interessanti, iż-żieda ta' L-ornithine mal-mezz tal-brodu tad-destrosju tal-patata (PDB) naqqset b'mod sinifikanti l-espressjoni tal-ġene SsOAH fil-miċelja ta' S. sclerotiorum. Bl-istess mod, l-applikazzjoni eżoġena ta' L-ornithine naqqset b'mod sinifikanti l-espressjoni tal-ġene SsOAH fil-miċelji fungali miġbura minn pjanti ttrattati. Fl-aħħar nett, l-applikazzjoni ta' L-ornithine naqqset b'mod sinifikanti s-sekrezzjoni tal-aċidu ossaliku kemm fil-mezz PDB kif ukoll fil-weraq infettati. Bħala konklużjoni, L-ornithine għandu rwol ewlieni fiż-żamma tal-istatus redox kif ukoll fit-titjib tar-rispons ta' difiża tal-pjanti infettati. Ir-riżultati ta' dan l-istudju jistgħu jgħinu fl-iżvilupp ta' metodi innovattivi u li ma jagħmlux ħsara lill-ambjent biex jikkontrollaw il-moffa bajda u jimmitigaw l-impatt tagħha fuq il-produzzjoni tal-fażola u għelejjel oħra.
Il-moffa bajda, ikkawżata mill-fungus nekrotrofiku Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, hija marda devastanti li tnaqqas ir-rendiment u li toħloq theddida serja għall-produzzjoni globali tal-fażola (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum hija waħda mill-patoġeni fungali tal-pjanti li jinġarru mill-ħamrija l-aktar diffiċli biex jiġu kkontrollati, b'firxa wiesgħa ta' ospitanti ta' aktar minn 600 speċi ta' pjanti u l-abbiltà li timmaċera malajr it-tessuti ospitanti b'mod mhux speċifiku (Liang and Rollins, 2018). Taħt kundizzjonijiet mhux favorevoli, tgħaddi minn fażi kritika taċ-ċiklu tal-ħajja tagħha, u tibqa' rieqda għal perjodi twal ta' żmien bħala strutturi suwed, iebsin, bħal żerriegħa msejħa 'sclerotia' fil-ħamrija jew bħala tkabbir abjad u artab fil-miċelju jew fil-qalba taz-zokk tal-pjanti infettati (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum kapaċi jifforma skleroti, li jippermettilu jibqa' ħaj f'għelieqi infettati għal perjodi twal ta' żmien u jippersisti waqt il-marda (Schwartz et al., 2005). L-iskleroti huma rikki fin-nutrijenti, jistgħu jippersistu fil-ħamrija għal perjodi twal, u jservu bħala l-inokulu primarju għal infezzjonijiet sussegwenti (Schwartz et al., 2005). Taħt kundizzjonijiet favorevoli, l-iskleroti jiġġerminaw u jipproduċu spori fl-arja li jistgħu jinfettaw il-partijiet kollha tal-pjanta 'l fuq mill-art, inklużi iżda mhux limitati għal fjuri, zkuk, jew imżiewed (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum juża strateġija b'ħafna livelli biex jinfetta l-pjanti ospitanti tiegħu, li tinvolvi serje ta' avvenimenti kkoordinati mill-ġerminazzjoni sklerotijali sal-iżvilupp tas-sintomi. Inizjalment, S. sclerotiorum jipproduċi spori sospiżi (imsejħa askospori) minn strutturi simili għal faqqiegħ imsejħa apoteċja, li jsiru fl-arja u jiżviluppaw fi skleroti mhux motili fuq debris tal-pjanti infettati (Bolton et al., 2006). Il-fungus imbagħad jnixxi l-aċidu ossaliku, fattur ta' virulenza, biex jikkontrolla l-pH tal-ħajt taċ-ċellula tal-pjanta, jippromwovi d-degradazzjoni enżimatika u l-invażjoni tat-tessuti (Hegedus and Rimmer, 2005), u jrażżan it-tifqigħa ossidattiva tal-pjanta ospitanti. Dan il-proċess ta' aċidifikazzjoni jdgħajjef il-ħajt taċ-ċellula tal-pjanta, u jipprovdi ambjent favorevoli għall-operazzjoni normali u effiċjenti tal-enzimi li jiddegradaw il-ħajt taċ-ċellula fungali (CWDEs), li jippermetti lill-patoġenu jegħleb il-barriera fiżika u jippenetra t-tessuti ospitanti (Marciano et al., 1983). Ladarba jippenetra, S. sclerotiorum jnixxi numru ta' CWDEs, bħal polygalacturonase u cellulase, li jiffaċilitaw it-tixrid tiegħu f'tessuti infettati u jikkawżaw nekrożi tat-tessuti. Il-progressjoni tal-leżjonijiet u t-twapet tal-ifi twassal għas-sintomi karatteristiċi tal-moffa bajda (Hegedus and Rimmer, 2005). Sadanittant, il-pjanti ospitanti jagħrfu mudelli molekulari assoċjati mal-patoġeni (PAMPs) permezz ta' riċetturi ta' rikonoxximent ta' mudelli (PRRs), u b'hekk jattivaw serje ta' avvenimenti ta' sinjalazzjoni li fl-aħħar mill-aħħar jattivaw risponsi ta' difiża.
Minkejja għexieren ta' snin ta' sforzi għall-kontroll tal-mard, għad hemm nuqqas ta' ġermplażma reżistenti adegwata fil-fażola, bħal f'għelejjel kummerċjali oħra, minħabba r-reżistenza, is-sopravivenza, u l-adattabilità tal-patoġenu. Għalhekk, il-ġestjoni tal-mard hija estremament ta' sfida u teħtieġ strateġija integrata u b'ħafna aspetti li tinkludi taħlita ta' prattiki kulturali, kontroll bijoloġiku, u funġiċidi kimiċi (O'Sullivan et al., 2021). Il-kontroll kimiku tal-moffa bajda huwa l-aktar effettiv għaliex il-funġiċidi, meta jiġu applikati b'mod korrett u fil-ħin it-tajjeb, jistgħu jikkontrollaw b'mod effettiv it-tixrid tal-marda, inaqqsu s-severità tal-infezzjoni, u jimminimizzaw it-telf fir-rendiment. Madankollu, l-użu żejjed u d-dipendenza żejda fuq il-funġiċidi jistgħu jwasslu għall-emerġenza ta' razez reżistenti ta' S. sclerotiorum u jkollhom impatt negattiv fuq organiżmi mhux fil-mira, is-saħħa tal-ħamrija, u l-kwalità tal-ilma (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Għalhekk, is-sejba ta' alternattivi li ma jagħmlux ħsara lill-ambjent saret prijorità ewlenija.
Il-poliamini (PAs), bħal putrescine, spermidine, spermine, u cadaverine, jistgħu jservu bħala alternattivi promettenti kontra l-patoġeni tal-pjanti li jinġarru mill-ħamrija, u b'hekk inaqqsu kompletament jew parzjalment l-użu ta' funġiċidi kimiċi perikolużi (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Fil-pjanti ogħla, il-PAs huma involuti f'ħafna proċessi fiżjoloġiċi inklużi, iżda mhux limitati għal, id-diviżjoni taċ-ċelluli, id-differenzjazzjoni, u r-rispons għal stress abijotiku u bijotiku (Killiny u Nehela, 2020). Jistgħu jaġixxu bħala antiossidanti, jgħinu biex ineħħu l-ispeċi reattivi tal-ossiġnu (ROS), iżommu l-omeostażi redox (Nehela and Killiny, 2023), jinduċu ġeni relatati mad-difiża (Romero et al., 2018), jirregolaw diversi mogħdijiet metaboliċi (Nehela and Killiny, 2023), jimmodulaw fitormoni endoġeni (Nehela and Killiny, 2019), jistabbilixxu reżistenza sistemika akkwistata (SAR), u jirregolaw l-interazzjonijiet bejn il-pjanti u l-patoġeni (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Ta' min jinnota li l-mekkaniżmi u r-rwoli speċifiċi tal-PAs fid-difiża tal-pjanti jvarjaw skont l-ispeċi tal-pjanti, il-patoġeni, u l-kundizzjonijiet ambjentali. L-aktar PA abbundanti fil-pjanti huwa bijosintetizzat mill-poliamina essenzjali L-ornithine (Killiny and Nehela, 2020).
L-ornithine għandu rwoli multipli fit-tkabbir u l-iżvilupp tal-pjanti. Pereżempju, studji preċedenti wrew li fir-ross (Oryza sativa), l-ornithine jista' jkun assoċjat mar-riċiklaġġ tan-nitroġenu (Liu et al., 2018), ir-rendiment, il-kwalità u l-aroma tar-ross (Lu et al., 2020), u r-rispons għall-istress tal-ilma (Yang et al., 2000). Barra minn hekk, l-applikazzjoni eżoġena ta' L-ornithine tejbet b'mod sinifikanti t-tolleranza għan-nixfa fil-pitravi taz-zokkor (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) u naqqset l-istress tal-melħ fil-pjanti tal-basal (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu u Çavuşoǧlu, 2021) u tal-anakardju (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Ir-rwol potenzjali ta' L-ornithine fid-difiża kontra l-istress abjotiku jista' jkun minħabba l-involviment tiegħu fl-akkumulazzjoni tal-prolina fil-pjanti ttrattati. Pereżempju, ġeni relatati mal-metaboliżmu tal-prolina, bħall-ġeni ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) u proline dehydrogenase (ProDH1 u ProDH2), ġew irrappurtati qabel li huma involuti fid-difiża ta' Nicotiana benthamiana u Arabidopsis thaliana kontra razez ta' Pseudomonas syringae mhux ospitanti (Senthil-Kumar u Mysore, 2012). Min-naħa l-oħra, l-ornithine decarboxylase fungali (ODC) hija meħtieġa għat-tkabbir tal-patoġeni (Singh et al., 2020). L-immirar tal-ODC ta' Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici permezz tas-silencing tal-ġeni indott mill-ospitant (HIGS) tejjeb b'mod sinifikanti r-reżistenza tal-pjanti tat-tadam għad-dbiel tal-Fusarium (Singh et al., 2020). Madankollu, ir-rwol potenzjali tal-applikazzjoni eżoġena tal-ornitina kontra stress bijotiku bħal fitopatoġeni ma ġiex studjat sew. Aktar importanti minn hekk, l-effetti tal-ornitina fuq ir-reżistenza għall-mard u l-fenomeni bijokimiċi u fiżjoloġiċi assoċjati għadhom fil-biċċa l-kbira mhux esplorati.
Il-fehim tal-kumplessità tal-infezzjoni tal-legumi minn S. sclerotiorum huwa importanti għall-iżvilupp ta' strateġiji ta' kontroll effettivi. F'dan l-istudju, immirajna li nidentifikaw ir-rwol potenzjali tad-diamine L-ornithine bħala fattur ewlieni fit-titjib tal-mekkaniżmi ta' difiża u r-reżistenza tal-pjanti tal-legumi għall-infezzjoni ta' Sclerotinia sclerotiorum. Aħna nissoponu li, minbarra li jtejjeb ir-risponsi ta' difiża tal-pjanti infettati, L-ornithine għandu wkoll rwol ewlieni fiż-żamma tal-istatus redox. Nipproponu li l-effetti potenzjali ta' L-ornithine huma relatati mar-regolazzjoni ta' mekkaniżmi ta' difiża antiossidanti enżimatiċi u mhux enżimatiċi u l-interferenza mal-fatturi ta' patoġeniċità/virulenza fungali u l-proteini assoċjati. Din il-funzjonalità doppja ta' L-ornithine tagħmilha kandidat promettenti għal strateġija sostenibbli biex tittaffa l-impatt tal-moffa bajda u tittejjeb ir-reżistenza tal-għelejjel komuni tal-legumi għal dan il-patoġenu fungali qawwi. Ir-riżultati tal-istudju preżenti jistgħu jgħinu fl-iżvilupp ta' metodi innovattivi u favur l-ambjent biex tiġi kkontrollata l-moffa bajda u jitnaqqas l-impatt tagħha fuq il-produzzjoni tal-legumi.
F'dan l-istudju, varjetà kummerċjali suxxettibbli ta' fażola komuni, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), intużat bħala materjal sperimentali. Żrieragħ b'saħħithom ġew ġentilment ipprovduti mid-Dipartiment tar-Riċerka tal-Legumi, l-Istitut tar-Riċerka tal-Uċuħ tar-Raba' fl-Għelieqi (FCRI), iċ-Ċentru tar-Riċerka Agrikola (ARC), l-Eġittu. Ħames żrieragħ ġew miżrugħa fi qsari tal-plastik (dijametru intern 35 ċm, fond 50 ċm) mimlija b'ħamrija infettata b'S. sclerotiorum taħt kundizzjonijiet ta' serra (25 ± 2 °C, umdità relattiva 75 ± 1%, 8 sigħat dawl/16-il siegħa dlam). 7–10 ijiem wara ż-żrigħ (DPS), in-nebbieta ġew irqaqin biex jitħallew biss żewġ nebbieta bi tkabbir uniformi u tliet weraq estiżi għalkollox f'kull borma. Il-pjanti kollha fil-qsari ġew mogħtija l-ilma darba kull ġimagħtejn u fertilizzati kull xahar bir-rata rakkomandata għall-varjetà partikolari.
Biex tiġi ppreparata konċentrazzjoni ta' 500 mg/L ta' L-ornithinediamine (magħruf ukoll bħala (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, il-Ġermanja), 50 mg l-ewwel ġew maħlula f'100 mL ta' ilma distillat sterili. Is-soluzzjoni stokk imbagħad ġiet dilwita u użata f'esperimenti sussegwenti. Fil-qosor, sitt serje ta' konċentrazzjonijiet ta' L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100, u 125 mg/L) ġew ittestjati in vitro. Barra minn hekk, ilma distillat sterili ntuża bħala kontroll negattiv (Mock) u l-funġiċida kummerċjali "Rizolex-T" 50% trab li jista' jixxarrab (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, l-Eġittu) intuża bħala kontroll pożittiv. Il-funġiċida kummerċjali “Rizolex-T” ġie ttestjat in vitro f’ħames konċentrazzjonijiet (2, 4, 6, 8 u 10 mg/L).
Kampjuni ta’ zkuk u miżwed tal-fażola komuni li juru sintomi tipiċi ta’ moffa bajda (rata ta’ infestazzjoni: 10–30%) inġabru minn irziezet kummerċjali. Għalkemm il-biċċa l-kbira tal-materjali tal-pjanti infettati ġew identifikati skont l-ispeċi/varjetà (varjetà kummerċjali suxxettibbli Giza 3), oħrajn, speċjalment dawk miksuba minn swieq lokali, kienu ta’ speċi mhux magħrufa. Il-materjali infettati miġbura l-ewwel ġew diżinfettati fil-wiċċ b’soluzzjoni ta’ 0.5% sodium hypochlorite għal 3 minuti, imbagħad laħlħu diversi drabi b’ilma distillat sterili u nixxfu b’karta tal-filtru sterili biex jitneħħa l-ilma żejjed. L-organi infettati mbagħad inqatgħu f’biċċiet żgħar mit-tessut tan-nofs (bejn tessuti b’saħħithom u infettati), ikkultivati ​​fuq mezz ta’ potato dextrose agar (PDA) u inkubati f’25 ± 2 °C b’ċiklu ta’ 12-il siegħa dawl/12-il siegħa dlam għal 5 ijiem biex jistimulaw il-formazzjoni ta’ skleroti. Il-metodu tal-ponta miċeljali ntuża wkoll biex jippurifika iżolati fungali minn kulturi mħallta jew ikkontaminati. L-iżolat fungali purifikat ġie identifikat l-ewwel abbażi tal-karatteristiċi morfoloġiċi kulturali tiegħu u mbagħad ikkonfermat li huwa S. sclerotiorum abbażi ta’ karatteristiċi mikroskopiċi. Fl-aħħar nett, l-iżolati purifikati kollha ġew ittestjati għall-patoġeniċità fuq il-kultivar tal-fażola komuni suxxettibbli Giza 3 biex jissodisfaw il-postulati ta' Koch.
Barra minn hekk, l-iżolat l-aktar invażiv ta' S. sclerotiorum (iżolat #3) ġie kkonfermat aktar abbażi tas-sekwenzar ta' spacer traskritt intern (ITS) kif deskritt minn White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Fil-qosor, l-iżolati ġew ikkultivati ​​fil-brodu tad-destrosju tal-patata (PDB) u inkubati f'25 ± 2 °C għal 5–7 ijiem. Il-miċelju fungali mbagħad inġabar, ġie ffiltrat minn ġo garża, maħsul darbtejn b'ilma sterili, u mnixxef b'karta tal-filtru sterili. Id-DNA ġenomiku ġie iżolat bl-użu tal-Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Ir-reġjun tal-ITS rDNA mbagħad ġie amplifikat bl-użu tal-par speċifiku ta' primers ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; daqs mistenni: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Il-prodotti tal-PCR purifikati ġew sottomessi għas-sekwenzar (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Is-sekwenzi tal-ITS rDNA ġew sekwenzati bidirezzjonalment bl-użu tal-metodu ta' sekwenzar Sanger. Is-sekwenzi tal-mistoqsijiet immuntati mbagħad ġew imqabbla mal-aħħar dejta f'GenBank u fiċ-Ċentru Nazzjonali għall-Informazzjoni dwar il-Bijoteknoloġija (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) bl-użu tas-softwer BLASTn. Is-sekwenza tal-mistoqsijiet ġiet imqabbla ma' 20 razza/iżolat ieħor ta' S. sclerotiorum irkuprati mill-aħħar dejta f'NCBI GenBank (Tabella Supplimentari S1) bl-użu ta' ClustalW fil-Pakkett tal-Analiżi Ġenetika Evoluzzjonarja Molekulari (MEGA-11; verżjoni 11) (Kumar et al., 2024). L-analiżi evoluzzjonarja twettqet bl-użu tal-metodu tal-probabbiltà massima u l-mudell ġenerali ta' sostituzzjoni tan-nukleotidi riversibbli fil-ħin (Nei and Kumar, 2000). Is-siġra bl-ogħla log-likelihood hija murija. Is-siġra inizjali għat-tfittxija ewristika hija magħżula billi tintgħażel is-siġra bl-ogħla log-likelihood bejn is-siġra neighbor-joining (NJ) (Kumar et al., 2024) u s-siġra tal-maximum parsimony (MP). Is-siġra NJ ġiet mibnija bl-użu ta' matriċi ta' distanza f'pari kkalkulata bl-użu tal-mudell ġenerali riversibbli fil-ħin (Nei and Kumar, 2000).
L-attività antibatterika ta' L-ornithine u l-batteriċida "Rizolex-T" ġiet determinata in vitro bil-metodu ta' diffużjoni tal-agar. Metodu: Ħu l-ammont xieraq tas-soluzzjoni stokk ta' L-ornithine (500 mg/L) u ħalltu sewwa ma' 10 ml tal-mezz nutrittiv PDA biex tipprepara soluzzjonijiet b'konċentrazzjonijiet finali ta' 12.5, 25, 50, 75, 100 u 125 mg/L, rispettivament. Ħames konċentrazzjonijiet tal-funġiċida "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 u 10 mg/L) u ilma distillat sterili ntużaw bħala kontroll. Wara li l-mezz issolidifika, plagg miċeljali ppreparat frisk ta' kultura ta' Sclerotinia sclerotiorum, b'dijametru ta' 4 mm, ġie trasferit fiċ-ċentru tad-dixx Petri u kkultivat f'25±2°C sakemm il-miċelju kopra d-dixx Petri ta' kontroll kollu, u wara dan ġie rreġistrat it-tkabbir fungali. Ikkalkula l-perċentwal ta' inibizzjoni tat-tkabbir radjali ta' S. sclerotiorum bl-użu tal-ekwazzjoni 1:
L-esperiment ġie ripetut darbtejn, b'sitt repliki bijoloġiċi għal kull grupp ta' kontroll/sperimentali u ħames qsari (żewġ pjanti għal kull qasrija) għal kull replika bijoloġika. Kull replika bijoloġika ġiet analizzata darbtejn (żewġ repliki tekniċi) biex tiġi żgurata l-eżattezza, l-affidabbiltà u r-riproduċibbiltà tar-riżultati sperimentali. Barra minn hekk, intużat analiżi ta' rigressjoni probit biex tikkalkula l-konċentrazzjoni inibitorja ta' nofs il-massimu (IC50) u l-IC99 (Prentice, 1976).
Biex jiġi evalwat il-potenzjal ta' L-ornithine f'kundizzjonijiet ta' serra, saru żewġ esperimenti konsekuttivi fil-qsari. Fil-qosor, il-qsari mtlew b'ħamrija sterilizzata tat-tafal u r-ramel (3:1) u ġew inokulati b'kultura ppreparata friska ta' S. sclerotiorum. L-ewwel, l-iżolat l-aktar invażiv ta' S. sclerotiorum (iżolat #3) ġie kkultivat billi sklerozju wieħed inqata' min-nofs, tqiegħed wiċċu 'l isfel fuq PDA u ġie inkubat f'25°C fid-dlam kostanti (24 siegħa) għal 4 ijiem biex jistimula t-tkabbir miċeljali. Imbagħad ittieħdu erba' tappijiet tal-agar b'dijametru ta' 5 mm mit-tarf ta' quddiem u ġew inokulati b'100 g ta' taħlita sterili ta' qamħ u nuħħala tar-ross (1:1, v/v) u l-fliexken kollha ġew inkubati f'25 ± 2 °C taħt ċiklu ta' 12-il siegħa dawl/12-il siegħa dlam għal 5 ijiem biex jistimulaw il-formazzjoni tal-iskleroti. Il-kontenut tal-fliexken kollha tħallat sewwa biex tiġi żgurata l-omoġenjità qabel ma żdiedet il-ħamrija. Imbagħad, 100 g tat-taħlita tal-bran kolonizzanti ġew miżjuda ma' kull borma biex tiġi żgurata konċentrazzjoni kostanti ta' patoġeni. Il-qsari inokulati ġew mogħtija l-ilma biex jiġi attivat it-tkabbir tal-fungi u tqiegħdu f'kundizzjonijiet ta' serra għal 7 ijiem.
Imbagħad inżergħu ħames żerriegħa tal-varjetà Giza 3 f'kull borma. Għall-qsari ttrattati b'L-ornithine u l-funġiċida Rizolex-T, iż-żerriegħa sterilizzata l-ewwel ġiet mxarrba għal sagħtejn f'soluzzjoni akwea taż-żewġ komposti b'konċentrazzjoni finali ta' IC99 ta' madwar 250 mg/L u 50 mg/L, rispettivament, u mbagħad imnixxfa bl-arja għal siegħa qabel iż-żrigħ. Min-naħa l-oħra, iż-żerriegħa ġiet mxarrba f'ilma distillat sterili bħala kontroll negattiv. Wara 10 ijiem, qabel l-ewwel tisqija, in-nebbieta ġew irqaq, u ħallew biss żewġ nebbieta puliti f'kull borma. Barra minn hekk, biex tiġi żgurata infezzjoni b'S. sclerotiorum, iz-zkuk tal-pjanta tal-fażola fl-istess stadju ta' żvilupp (10 ijiem) inqatgħu f'żewġ postijiet differenti bl-użu ta' skalpell sterilizzat u madwar 0.5 g tat-taħlita tal-bran kolonizzanti tqiegħdet f'kull ferita, segwita minn umdità għolja biex tistimula l-infezzjoni u l-iżvilupp tal-marda fil-pjanti kollha inokulati. Il-pjanti ta' kontroll ġew midruba bl-istess mod u ammont ugwali (0.5 g) ta' taħlita sterili ta' nuħħala u mhux kolonizzata tqiegħed fil-ferita u nżamm taħt umdità għolja biex jissimula l-ambjent għall-iżvilupp tal-marda u jiżgura konsistenza bejn il-gruppi ta' trattament.
Metodu ta' trattament: In-nebbieta tal-fażola ġew mogħtija l-ilma b'500 ml ta' soluzzjoni milwiema ta' L-ornithine (250 mg/l) jew il-funġiċida Rizolex-T (50 mg/l) billi ġiet irrigata l-ħamrija, imbagħad it-trattament ġie ripetut tliet darbiet f'intervall ta' 10 ijiem. Il-kontrolli ttrattati bil-plaċebo ġew mogħtija l-ilma b'500 ml ta' ilma distillat sterili. It-trattamenti kollha twettqu f'kundizzjonijiet ta' serra (25 ± 2°C, 75 ± 1% umdità relattiva, u fotoperjodu ta' 8 sigħat dawl/16-il siegħa dlam). Il-qsari kollha ġew mogħtija l-ilma kull ġimgħatejn u ttrattati kull xahar b'fertilizzant NPK bilanċjat (20-20-20, bi 3.6% kubrit u mikroelementi TE; Zain Seeds, l-Eġittu) b'konċentrazzjoni ta' 3–4 g/l permezz ta' bexx bil-weraq skont ir-rakkomandazzjonijiet għall-varjetà speċifika u l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Sakemm ma jkunx iddikjarat mod ieħor, weraq maturi estiżi għalkollox (it-tieni u t-tielet werqa minn fuq) inġabru minn kull replika bijoloġika 72 siegħa wara t-trattament (hpt), inġabru, ġew omoġenizzati, miġbura u maħżuna f'temperatura ta' -80 °C għal aktar analiżi inklużi, iżda mhux limitati għal, lokalizzazzjoni istokimika in situ ta' indikaturi ta' stress ossidattiv, perossidazzjoni tal-lipidi, antiossidanti enżimatiċi u mhux enżimatiċi u espressjoni tal-ġeni.
L-intensità tal-infezzjoni tal-moffa bajda ġiet ivvalutata kull ġimgħa 21 jum wara l-inokulazzjoni (dpi) bl-użu ta' skala ta' 1–9 (Tabella Supplimentari S2) ibbażata fuq l-iskala ta' Petzoldt u Dickson (1996) modifikata minn Teran et al. (2006). Fil-qosor, iz-zkuk u l-friegħi tal-pjanti tal-fażola ġew eżaminati billi bdew mill-punt tal-inokulazzjoni biex isegwu l-progressjoni tal-leżjonijiet tul l-internodi u n-nodi. Id-distanza tal-leżjoni mill-punt tal-inokulazzjoni sal-aktar punt 'il bogħod tul iz-zokk jew il-fergħa mbagħad tkejlet u ġie assenjat punteġġ ta' 1–9 ibbażat fuq il-post tal-leżjoni, fejn (1) ma indikat l-ebda infezzjoni viżibbli ħdejn il-punt tal-inokulazzjoni u (2–9) indikat żieda gradwali fid-daqs tal-leżjoni u l-progressjoni tul in-nodi/internodi (Tabella Supplimentari S2). L-intensità tal-infezzjoni tal-moffa bajda mbagħad ġiet konvertita f'perċentwal bl-użu tal-formula 2:
Barra minn hekk, l-erja taħt il-kurva tal-progressjoni tal-marda (AUDPC) ġiet ikkalkulata bl-użu tal-formula (Shaner u Finney, 1977), li ġiet adattata reċentement għat-taħsir abjad tal-fażola komuni (Chauhan et al., 2020) bl-użu tal-ekwazzjoni 3:
Fejn Yi = is-severità tal-marda fil-ħin ti, Yi+1 = is-severità tal-marda fil-ħin li jmiss ti+1, ti = ħin tal-ewwel kejl (f'jiem), ti+1 = ħin tal-kejl li jmiss (f'jiem), n = numru totali ta' punti ta' ħin jew punti ta' osservazzjoni. Il-parametri tat-tkabbir tal-pjanta tal-fażola inkluż l-għoli tal-pjanta (cm), in-numru ta' friegħi għal kull pjanta, u n-numru ta' weraq għal kull pjanta ġew irreġistrati kull ġimgħa għal 21 jum fir-repliki bijoloġiċi kollha.
F'kull replika bijoloġika, inġabru kampjuni tal-weraq (it-tieni u t-tielet weraq żviluppati għalkollox minn fuq) fil-jum 45 wara t-trattament (15-il jum wara l-aħħar trattament). Kull replika bijoloġika kienet tikkonsisti f'ħames qsari (żewġ pjanti għal kull borma). Madwar 500 mg tat-tessut mgħaffeġ intuża għall-estrazzjoni ta' pigmenti fotosintetiċi (klorofilla a, klorofilla b u karotenojdi) bl-użu ta' 80% aċetun f'4 °C fid-dlam. Wara 24 siegħa, il-kampjuni ġew ċentrifugati u s-supernatant inġabar għad-determinazzjoni tal-kontenut ta' klorofilla a, klorofilla b u karotenojdi kolorimetrikament bl-użu ta' spettrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, il-Ġappun) skont il-metodu ta' (Lichtenthaler, 1987) billi tkejjel l-assorbenza fi tliet wavelengths differenti (A470, A646 u A663 nm). Fl-aħħar, il-kontenut ta' pigmenti fotosintetiċi ġie kkalkulat bl-użu tal-formuli li ġejjin 4–6 deskritti minn Lichtenthaler (1987).
Wara 72 siegħa wara t-trattament (hpt), il-weraq (it-tieni u t-tielet weraq żviluppati għalkollox minn fuq) inġabru minn kull replika bijoloġika għal-lokalizzazzjoni istokimika in situ tal-perossidu tal-idroġenu (H2O2) u l-anjon superossidu (O2•−). Kull replika bijoloġika kienet tikkonsisti f'ħames qsari (żewġ pjanti għal kull borma). Kull replika bijoloġika ġiet analizzata f'duplikat (żewġ repliki tekniċi) biex tiġi żgurata l-eżattezza, l-affidabbiltà u r-riproduċibbiltà tal-metodu. H2O2 u O2•− ġew determinati bl-użu ta' 0.1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, il-Ġermanja) jew nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, il-Ġermanja), rispettivament, wara l-metodi deskritti minn Romero-Puertas et al. (2004) u Adam et al. (1989) b'modifiki żgħar. Għal-lokalizzazzjoni istokimika ta' H2O2 in situ, il-fuljetti ġew infiltrati bil-vakwu b'0.1% DAB f'10 mM Tris buffer (pH 7.8) u mbagħad inkubati f'temperatura tal-kamra fid-dawl għal 60 minuta. Il-fuljetti ġew ibbliċjati f'0.15% (v/v) TCA f'4:1 (v/v) etanol:kloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kajr, Eġittu) u mbagħad esposti għad-dawl sakemm skuraw. Bl-istess mod, il-valvi ġew infiltrati bil-vakwu b'10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.8) li kien fih 0.1 w/v % HBT għal-lokalizzazzjoni istokimika ta' O2•− in situ. Il-fuljetti ġew inkubati fid-dawl f'temperatura tal-kamra għal 20 minuta, imbagħad ibbliċjati kif imsemmi hawn fuq, u mbagħad illuminati sakemm dehru tikek blu skuri/vjola. L-intensità tal-kulur kannella (bħala indikatur tal-H2O2) jew blu-vjola (bħala indikatur tal-O2•−) li jirriżulta ġiet ivvalutata bl-użu tal-verżjoni ta' Fiġi tal-pakkett tal-ipproċessar tal-immaġni ImageJ (http://fiji.sc; aċċessata fis-7 ta' Marzu 2024).
Il-malondialdehyde (MDA; bħala indikatur tal-perossidazzjoni tal-lipidi) ġie determinat skont il-metodu ta' Du u Bramlage (1992) b'modifiki żgħar. Il-weraq minn kull replika bijoloġika (it-tieni u t-tielet weraq żviluppati għalkollox minn fuq) inġabru 72 siegħa wara t-trattament (hpt). Kull replika bijoloġika inkludiet ħames qsari (żewġ pjanti għal kull borma). Kull replika bijoloġika ġiet analizzata f'duplikat (żewġ repliki tekniċi) biex tiġi żgurata l-eżattezza, l-affidabbiltà u r-riproduċibbiltà tal-metodu. Fil-qosor, 0.5 g ta' tessut tal-weraq mitħun intuża għall-estrazzjoni tal-MDA b'20% aċidu trikloroaċetiku (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) li fih 0.01% butilat idrossitoluene (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Il-kontenut tal-MDA fis-supernatant imbagħad ġie determinat kolorimetrikament billi tkejlet l-assorbenza f'532 u 600 nm bl-użu ta' spettrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, il-Ġappun) u mbagħad espress bħala nmol g−1 FW.
Għall-valutazzjoni tal-antiossidanti enżimatiċi u mhux enżimatiċi, inġabru l-weraq (it-tieni u t-tielet weraq żviluppati għalkollox minn fuq) minn kull replika bijoloġika 72 siegħa wara t-trattament (hpt). Kull replika bijoloġika kienet tikkonsisti f'ħames qsari (żewġ pjanti għal kull borma). Kull kampjun bijoloġiku ġie analizzat f'duplikat (żewġ kampjuni tekniċi). Żewġ weraq ġew mitħuna b'nitroġenu likwidu u użati direttament għad-determinazzjoni tal-antiossidanti enżimatiċi u mhux enżimatiċi, l-aċidi amminiċi totali, il-kontenut tal-prolina, l-espressjoni tal-ġeni, u l-kwantifikazzjoni tal-ossalat.
Il-fenoliċi totali solubbli ġew determinati bl-użu tar-reaġent Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) b'modifiki żgħar tal-metodu deskritt minn Kahkonen et al. (1999). Fil-qosor, madwar 0.1 g ta' tessut tal-werqa omoġenizzat ġie estratt b'20 ml 80% metanol fid-dlam għal 24 siegħa u s-supernatant inġabar wara ċ-ċentrifugazzjoni. 0.1 ml tal-estratt tal-kampjun tħallat ma' 0.5 ml reaġent Folin-Ciocalteu (10%), tħawwad għal 30 sekonda u tħalla fid-dlam għal 5 minuti. Imbagħad 0.5 ml ta' soluzzjoni ta' 20% sodium carbonate (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypt) ġiet miżjuda ma' kull tubu, imħallta sewwa u inkubata f'temperatura tal-kamra fid-dlam għal siegħa. Wara l-inkubazzjoni, l-assorbenza tat-taħlita tar-reazzjoni tkejlet f'765 nm bl-użu ta' spettrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Ġappun). Il-konċentrazzjoni ta' fenoli totali solubbli fl-estratti tal-kampjun ġiet determinata bl-użu ta' kurva ta' kalibrazzjoni tal-aċidu galliku (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) u espressa bħala milligrammi ta' ekwivalenti ta' aċidu galliku għal kull gramma ta' piż frisk (mg GAE g-1 piż frisk).
Il-kontenut totali ta' flavonoid solubbli ġie determinat skont il-metodu ta' Djeridane et al. (2006) b'modifiki żgħar. Fil-qosor, 0.3 ml tal-estratt tal-metanol ta' hawn fuq tħallat ma' 0.3 ml ta' soluzzjoni ta' 5% klorur tal-aluminju (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), tħawwad sew u mbagħad inkubat f'temperatura tal-kamra għal 5 minuti, segwit biż-żieda ta' 0.3 ml ta' soluzzjoni ta' 10% aċetat tal-potassju (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt), tħallat sewwa u inkubat f'temperatura tal-kamra għal 30 minuta fid-dlam. Wara l-inkubazzjoni, l-assorbenza tat-taħlita tar-reazzjoni tkejlet f'430 nm bl-użu ta' spettrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Ġappun). Il-konċentrazzjoni ta' flavonoids solubbli totali fl-estratti tal-kampjuni ġiet determinata bl-użu ta' kurva ta' kalibrazzjoni tar-rutina (TCI America, Portland, OR, USA) u mbagħad espressa bħala milligrammi ta' ekwivalenti ta' rutina għal kull gramma ta' piż frisk (mg RE g-1 piż frisk).
Il-kontenut totali ta' amino acidi ħielsa fil-weraq tal-fażola ġie determinat bl-użu ta' reaġent ta' ninhydrin modifikat (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ibbażat fuq il-metodu propost minn Yokoyama u Hiramatsu (2003) u modifikat minn Sun et al. (2006). Fil-qosor, 0.1 g ta' tessut mitħun ġie estratt b'buffer ta' pH 5.4, u 200 μL tas-supernatant irreaġixxew ma' 200 μL ta' ninhydrin (2%) u 200 μL ta' pyridine (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), inkubati f'banju ta' ilma jagħli għal 30 minuta, imbagħad imkessħin u mkejla f'580 nm bl-użu ta' spettrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Ġappun). Min-naħa l-oħra, il-proline ġiet determinata bil-metodu Bates (Bates et al., 1973). Il-prolina ġiet estratta bi 3% aċidu sulfosaliċiliku (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) u wara ċ-ċentrifugazzjoni, 0.5 ml tas-supernatant tħallat ma' 1 ml aċidu aċetiku glaċjali (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) u reaġent tan-ninhydrin, inkubat f'90°C għal 45 minuta, imkessaħ u mkejjel f'520 nm bl-użu tal-istess spettrofotometru bħal hawn fuq. L-aċidi amminiċi ħielsa totali u l-prolina fl-estratti tal-weraq ġew determinati bl-użu ta' kurvi ta' kalibrazzjoni tal-gliċina u l-prolina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), rispettivament, u espressi bħala mg/g piż frisk.
Biex tiġi ddeterminata l-attività enżimatika tal-enzimi antiossidanti, madwar 500 mg ta' tessut omoġenizzat ġie estratt bi 3 ml ta' 50 mM Tris buffer (pH 7.8) li kien fih 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) u 7.5% polyvinylpyrrolidone (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ġie ċċentrifugat b'10,000 × g għal 20 minuta taħt refriġerazzjoni (4 °C), u s-supernatant (estratt tal-enzima mhux raffinat) inġabar (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Imbagħad, il-katalażi (CAT) ġiet irreaġixxuta ma' 2 ml ta' 0.1 M buffer tas-sodju fosfat (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) u 100 μl ta' soluzzjoni ta' 269 mM H2O2 biex tiġi ddeterminata l-attività enżimatika tagħha skont il-metodu ta' Aebi (1984) b'modifiki żgħar (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). L-attività enżimatika tal-perossidażi dipendenti fuq il-guaiacol (POX) ġiet iddeterminata bl-użu tal-metodu ta' Harrach et al. (2009). (2008) b'modifiki żgħar (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) u l-attività enżimatika tal-polifenol ossidasi (PPO) ġiet determinata wara reazzjoni ma' 2.2 ml ta' 100 mM buffer tas-sodju fosfat (pH 6.0), 100 μl ta' guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, USA) u 100 μl ta' 12 mM H2O2. Il-metodu ġie modifikat xi ftit minn (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). L-assaġġ twettaq wara reazzjoni ma' 3 ml ta' soluzzjoni ta' catechol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) ippreparata friska f'0.1 M buffer tal-fosfat (pH 6.0). L-attività tas-CAT ġiet imkejla billi ġiet immonitorjata d-dekompożizzjoni tal-H2O2 f'240 nm (A240), l-attività tal-POX ġiet imkejla billi ġiet immonitorjata ż-żieda fl-assorbenza f'436 nm (A436), u l-attività tal-PPO ġiet imkejla billi ġew irreġistrati l-varjazzjonijiet fl-assorbenza f'495 nm (A495) kull 30 s għal 3 minuti bl-użu ta' spettrofotometru UV-160A (Shimadzu, il-Ġappun).
RT-PCR f'ħin reali ntuża biex jinstabu l-livelli ta' traskrizzjoni ta' tliet ġeni relatati mal-antiossidanti, inkluż peroxisomal catalase (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoxide dismutase (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), u glutathione reductase (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), fil-weraq tal-fażola (it-tieni u t-tielet weraq żviluppati kompletament minn fuq) 72 siegħa wara l-aħħar trattament. Fil-qosor, l-RNA ġie iżolat bl-użu tas-Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, iċ-Ċina) skont il-protokoll tal-manifattur. Imbagħad, is-cDNA ġie sintetizzat bl-użu tas-TOP script™ cDNA Synthesis Kit skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Is-sekwenzi tal-primer tat-tliet ġeni ta' hawn fuq huma elenkati fit-Tabella Supplimentari S3. PvActin-3 (numru ta' aċċessjoni tal-GenBank: XM_068616709.1) intuża bħala l-ġene intern u l-espressjoni relattiva tal-ġene ġiet ikkalkulata bl-użu tal-metodu 2-ΔΔCT (Livak u Schmittgen, 2001). L-istabbiltà tal-actina taħt stress bijotiku (interazzjoni inkompatibbli bejn legumi komuni u l-fungus tal-antraknosi Colletotrichum lindemuthianum) u stress abijotiku (nixfa, salinità, temperatura baxxa) ġiet murija (Borges et al., 2012).
Inizjalment wettaqna analiżi in silico tal-ġenoma kollu tal-proteini oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) f'S. sclerotiorum bl-użu tal-għodda BLAST proteina-proteina (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Fil-qosor, użajna OAH minn Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; numru ta' aċċessjoni GenBank XP_040799428.1; 342 aċidu amminiku) u Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; numru ta' aċċessjoni GenBank XP_056833920.1; 316 aċidu amminiku) bħala sekwenzi ta' mistoqsijiet biex nimmappjaw il-proteina omologa f'S. sclerotiorum (taxide: 5180). BLASTp twettaq kontra l-aktar dejta reċenti disponibbli dwar il-ġenoma ta' S. sclerotiorum f'GenBank fuq il-websajt taċ-Ċentru Nazzjonali għall-Informazzjoni dwar il-Bijoteknoloġija (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Barra minn hekk, il-ġene OAH imbassar minn S. sclerotiorum (SsOAH) u l-analiżi evoluzzjonarja u s-siġra filogenetika ta' AfOAH minn A. fijiensis CBS 313.89 u PlOAH minn P. lagena ġew inferiti bl-użu tal-metodu tal-probabbiltà massima f'MEGA11 (Tamura et al., 2021) u l-mudell ibbażat fuq il-matriċi JTT (Jones et al., 1992). Is-siġra filogenetika ġiet ikkombinata mal-analiżi tal-allinjament multiplu tas-sekwenzi tal-proteini tal-ġeni OAH imbassra kollha (SsOAH) minn S. sclerotiorum u s-sekwenza tal-mistoqsija bl-użu tal-Għodda ta' Allinjament Ibbażata fuq Restrizzjonijiet (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos u Agarwala, 2007). Barra minn hekk, l-aħjar sekwenzi ta' aċidi amminiċi li jaqblu ta' SsOAH minn S. sclerotiorum ġew allinjati mas-sekwenzi tal-mistoqsijiet (AfOAH u PlOAH) (Larkin et al., 2007) bl-użu ta' ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), u r-reġjuni konservati fl-allinjament ġew viżwalizzati bl-użu tal-għodda ESPript (verżjoni 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Barra minn hekk, id-dominji rappreżentattivi funzjonali mbassra u s-siti konservati ta' S. sclerotiorum SsOAH ġew ikklassifikati b'mod interattiv f'familji differenti bl-użu tal-għodda InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Fl-aħħar nett, l-immudellar tal-istruttura tridimensjonali (3D) tal-S. sclerotiorum SsOAH imbassar twettaq bl-użu tal-Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) u ġie vvalidat bl-użu tas-server SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). L-istrutturi tridimensjonali mbassra (format PDB) ġew viżwalizzati b'mod interattiv bl-użu tal-pakkett UCSF-Chimera (verżjoni 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Intuża PCR fluworexxenti kwantitattiva f'ħin reali biex jiġi ddeterminat il-livell traskrizzjonali ta' oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH; numru ta' aċċessjoni tal-GenBank: XM_001590428.1) fil-miċelji ta' Sclerotinia sclerotiorum. Fil-qosor, S. sclerotiorum ġie inokulat fi flask li kien fih PDB u mqiegħed f'inkubatur li jitħawwad (mudell: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) f'25 ± 2 °C għal 24 siegħa b'150 rpm u fid-dlam kostanti (24 siegħa) biex jistimula t-tkabbir miċeljali. Wara dan, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'L-ornithine u l-funġiċida Rizolex-T f'konċentrazzjonijiet finali ta' IC50 (madwar 40 u 3.2 mg/L, rispettivament) u mbagħad ikkultivati ​​għal 24 siegħa oħra taħt l-istess kundizzjonijiet. Wara l-inkubazzjoni, il-kulturi ġew ċentrifugati b'2500 rpm għal 5 minuti u s-supernatant (miċelju fungali) inġabar għall-analiżi tal-espressjoni tal-ġeni. Bl-istess mod, il-miċelju fungali nġabar f'0, 24, 48, 72, 96, u 120 siegħa wara l-infezzjoni minn pjanti infettati li kienu ffurmaw moffa bajda u miċelju qoton fuq il-wiċċ tat-tessuti infettati. L-RNA ġie estratt mill-miċelju fungali u mbagħad is-cDNA ġie sintetizzat kif deskritt hawn fuq. Is-sekwenzi tal-primer għal SsOAH huma elenkati fit-Tabella Supplimentari S3. SsActin (numru ta' aċċessjoni tal-GenBank: XM_001589919.1) intuża bħala l-ġene housekeeping, u l-espressjoni relattiva tal-ġeni ġiet ikkalkulata bl-użu tal-metodu 2-ΔΔCT (Livak u Schmittgen, 2001).
L-aċidu ossaliku ġie determinat fil-brodu tad-destrosju tal-patata (PDB) u f'kampjuni tal-pjanti li fihom il-patoġenu fungali Sclerotinia sclerotiorum skont il-metodu ta' Xu u Zhang (2000) b'modifiki żgħar. Fil-qosor, l-iżolati ta' S. sclerotiorum ġew inokulati fi fliexken li fihom PDB u mbagħad ikkultivati ​​f'inkubatur li jitħawwad (mudell I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) b'150 rpm f'25 ± 2 °C għal 3–5 ijiem fid-dlam kostanti (24 siegħa) biex jistimulaw it-tkabbir miċeljali. Wara l-inkubazzjoni, il-kultura fungali l-ewwel ġiet iffiltrata permezz ta' karta tal-filtru Whatman #1 u mbagħad ċentrifugata b'2500 rpm għal 5 minuti biex jitneħħa l-miċelju residwu. Is-supernatant inġabar u nħażen f'4°C għal aktar determinazzjoni kwantitattiva tal-ossalat. Għat-tħejjija tal-kampjuni tal-pjanti, madwar 0.1 g ta' frammenti tat-tessut tal-pjanti ġew estratti tliet darbiet b'ilma distillat (2 ml kull darba). Il-kampjuni mbagħad ġew ċentrifugati b'2500 rpm għal 5 minuti, is-supernatant ġie ffiltrat niexef minn ġo karta tal-filtru Whatman Nru 1 u miġbur għal aktar analiżi.
Għall-analiżi kwantitattiva tal-aċidu ossaliku, it-taħlita tar-reazzjoni ġiet ippreparata f'tubu b'tapp tal-ħġieġ fl-ordni li ġejja: 0.2 ml ta' kampjun (jew filtrat tal-kultura PDB jew soluzzjoni standard tal-aċidu ossaliku), 0.11 ml ta' bromophenol blue (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0.198 ml ta' 1 M aċidu sulfuriku (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) u 0.176 ml ta' 100 mM potassium dichromate (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), u mbagħad is-soluzzjoni ġiet dilwita għal 4.8 ml b'ilma distillat, imħallta sew u mqiegħda immedjatament f'banju tal-ilma ta' 60 °C. Wara 10 minuti, ir-reazzjoni twaqqfet billi żdiedu 0.5 ml ta' soluzzjoni tas-sodium hydroxide (NaOH; 0.75 M). L-assorbenza (A600) tat-taħlita tar-reazzjoni tkejlet f'600 nm bl-użu ta' spettrofotometru UV-160 (Shimadzu Corporation, il-Ġappun). Il-PDB u l-ilma distillat intużaw bħala kontrolli għall-kwantifikazzjoni tal-filtrati tal-kultura u l-kampjuni tal-pjanti, rispettivament. Il-konċentrazzjonijiet tal-aċidu ossaliku fil-filtrati tal-kultura, espressi bħala mikrogrammi ta' aċidu ossaliku għal kull millilitru ta' mezz PDB (μg.mL−1), u fl-estratti tal-weraq, espressi bħala mikrogrammi ta' aċidu ossaliku għal kull gramma ta' piż frisk (μg.g−1 FW), ġew determinati bl-użu ta' kurva ta' kalibrazzjoni tal-aċidu ossaliku (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, l-Istati Uniti).
Matul l-istudju, l-esperimenti kollha ġew iddisinjati f'disinn kompletament każwali (CRD) b'sitt repliki bijoloġiċi għal kull trattament u ħames qsari għal kull replika bijoloġika (żewġ pjanti għal kull qasrija) sakemm ma jkunx iddikjarat mod ieħor. Ir-repliki bijoloġiċi ġew analizzati f'duplikat (żewġ repliki tekniċi). Ir-repliki tekniċi ntużaw biex tiġi vverifikata r-riproduċibbiltà tal-istess esperiment iżda ma ntużawx fl-analiżi statistika biex jiġu evitati repliki foloz. Id-dejta ġiet analizzata statistikament bl-użu tal-analiżi tal-varjanza (ANOVA) segwita mit-test ta' differenza sinifikanti onestament ta' Tukey-Kramer (HSD) (p ≤ 0.05). Għal esperimenti in vitro, il-valuri IC50 u IC99 ġew ikkalkulati bl-użu tal-mudell probit u ġew ikkalkulati intervalli ta' kunfidenza ta' 95%.
Total ta' erba' iżolati nġabru minn għelieqi differenti tas-sojja fil-Gvernatorat ta' El Ghabiya, l-Eġittu. Fuq il-mezz PDA, l-iżolati kollha pproduċew miċelju abjad kremuż li malajr sar abjad qisu qoton (Figura 1A) u mbagħad beige jew kannella fl-istadju tal-isklerozju. L-isklerożi ġeneralment ikunu densi, suwed, sferiċi jew irregolari fil-forma, twal minn 5.2 sa 7.7 mm u dijametru minn 3.4 sa 5.3 mm (Figura 1B). Għalkemm erba' iżolati żviluppaw mudell marġinali ta' sklerożi fit-tarf tal-mezz tal-kultura wara 10–12-il jum ta' inkubazzjoni f'25 ± 2 °C (Fig. 1A), in-numru ta' sklerożi għal kull pjanċa kien differenti b'mod sinifikanti fosthom (P < 0.001), bl-iżolat 3 ikollu l-ogħla numru ta' sklerożi (32.33 ± 1.53 sklerożi għal kull pjanċa; Fig. 1C). Bl-istess mod, l-iżolat #3 ipproduċa aktar aċidu ossaliku fil-PDB minn iżolati oħra (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Fig. 1D). L-iżolat #3 wera karatteristiċi morfoloġiċi u mikroskopiċi tipiċi tal-fungus fitopatoġeniku Sclerotinia sclerotiorum. Pereżempju, fuq il-PDA, il-kolonji tal-iżolat #3 kibru malajr, kienu abjad kremuż (Figura 1A), beige invers jew isfar-kannella ċar tas-salamun, u kienu jeħtieġu 6-7 ijiem f'25 ± 2°C biex ikopru kompletament il-wiċċ ta' pjanċa b'dijametru ta' 9 ċm. Abbażi tal-karatteristiċi morfoloġiċi u mikroskopiċi ta' hawn fuq, l-iżolat #3 ġie identifikat bħala Sclerotinia sclerotiorum.
Figura 1. Karatteristiċi u patoġeniċità ta' iżolati ta' S. sclerotiorum minn għelejjel komuni tal-legumi. (A) Tkabbir miċeljali ta' erba' iżolati ta' S. sclerotiorum fuq mezz PDA, (B) skleroti ta' erba' iżolati ta' S. sclerotiorum, (C) numru ta' skleroti (għal kull pjanċa), (D) sekrezzjoni ta' aċidu ossaliku fuq mezz PDB (μg.mL−1), u (E) severità tal-marda (%) ta' erba' iżolati ta' S. sclerotiorum fuq kultivar kummerċjali tal-legumi suxxettibbli Giza 3 taħt kundizzjonijiet ta' serra. Il-valuri jirrappreżentaw il-medja ± SD ta' ħames repliki bijoloġiċi (n = 5). Ittri differenti jindikaw differenzi statistikament sinifikanti bejn it-trattamenti (p < 0.05). (F–H) Sintomi tipiċi ta' moffa bajda dehru fuq zkuk u siliques 'il fuq mill-art, rispettivament, 10 ijiem wara l-inokulazzjoni bl-iżolat #3 (dpi). (I) Analiżi evoluttiva tar-reġjun tal-ispazjatur traskritt intern (ITS) tal-iżolat #3 ta' S. sclerotiorum twettqet bl-użu tal-metodu tal-probabbiltà massima u tqabblet ma' 20 iżolat/razza ta' referenza miksuba mid-database taċ-Ċentru Nazzjonali għall-Informazzjoni dwar il-Bijoteknoloġija (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). In-numri 'l fuq mil-linji ta' raggruppament jindikaw il-kopertura tar-reġjun (%), u n-numri taħt il-linji ta' raggruppament jindikaw it-tul tal-fergħa.
Barra minn hekk, biex tiġi kkonfermata l-patoġeniċità, erba' iżolati miksuba ta' S. sclerotiorum intużaw biex inokulaw il-kultivar kummerċjali tal-fażola suxxettibbli Giza 3 f'kundizzjonijiet ta' serra, li huwa konsistenti mal-postulati ta' Koch (Fig. 1E). Għalkemm l-iżolati fungali miksuba kollha kienu patoġeniċi u setgħu jinfettaw il-fażola ħadra (cv. Giza 3), u jikkawżaw sintomi tipiċi ta' moffa bajda fuq il-partijiet kollha 'l fuq mill-art (Fig. 1F), speċjalment fuq iz-zkuk (Fig. 1G) u l-imżiewed (Fig. 1H) 10 ijiem wara l-inokulazzjoni (dpi), l-iżolat 3 kien l-aktar iżolat aggressiv f'żewġ esperimenti indipendenti. L-iżolat 3 kellu l-ogħla severità tal-marda (%) fuq il-pjanti tal-fażola (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, u 76.7 ± 3.1 f'7, 14, u 21 jum wara l-infezzjoni, rispettivament; Figura 1F).
L-identifikazzjoni tal-iżolat #3 ta' S. sclerotiorum l-aktar invażiv ġiet ikkonfermata aktar abbażi tas-sekwenzar ta' spacer traskritt intern (ITS) (Fig. 1I). L-analiżi filoġenetika bejn l-iżolat #3 u 20 iżolat/razza ta' referenza wriet similarità għolja (>99%) bejniethom. Ta' min jinnota li l-iżolat #3 ta' S. sclerotiorum (533 bp) għandu similarità għolja mal-iżolat Amerikan ta' S. sclerotiorum LPM36 iżolat miż-żerriegħa tal-piżelli niexfa (numru ta' aċċessjoni tal-GenBank MK896659.1; 540 bp) u l-iżolat Ċiniż ta' S. sclerotiorum YKY211 (numru ta' aċċessjoni tal-GenBank OR206374.1; 548 bp), li jikkawża t-taħsir taz-zokk tal-vjola (Matthiola incana), li kollha huma miġbura separatament fil-parti ta' fuq tad-dendrogramma (Figura 1I). Is-sekwenza l-ġdida ġiet depożitata fid-database tal-NCBI u msemmija “Sclerotinia sclerotiorum – iżolat YN-25” (numru ta’ aċċessjoni tal-GenBank PV202792). Jidher li l-iżolat 3 huwa l-iżolat l-aktar invażiv; għalhekk, dan l-iżolat intgħażel għall-istudju fl-esperimenti sussegwenti kollha.
L-attività antibatterika tad-diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, il-Ġermanja) f'konċentrazzjonijiet differenti (12.5, 25, 50, 75, 100 u 125 mg/L) kontra l-iżolat 3 ta' S. sclerotiorum ġiet investigata in vitro. Ta' min jinnota li L-ornithine eżerċita effett antibatteriku u gradwalment inibixxa t-tkabbir radjali tal-ifi ta' S. sclerotiorum b'mod dipendenti mid-doża (Figura 2A, B). Fl-ogħla konċentrazzjoni ttestjata (125 mg/L), L-ornithine wera l-ogħla rata ta' inibizzjoni tat-tkabbir miċeljali (99.62 ± 0.27%; Figura 2B), li kienet ekwivalenti għall-funġiċida kummerċjali Rizolex-T (rata ta' inibizzjoni 99.45 ± 0.39%; Figura 2C) fl-ogħla konċentrazzjoni ttestjata (10 mg/L), li tindika effikaċja simili.
Figura 2. Attività antibatterika in vitro ta' L-ornithine kontra Sclerotinia sclerotiorum. (A) Paragun tal-attività antibatterika ta' konċentrazzjonijiet differenti ta' L-ornithine kontra S. sclerotiorum mal-funġiċida kummerċjali Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Rata ta' inibizzjoni (%) tat-tkabbir miċeljali ta' S. sclerotiorum wara trattament b'konċentrazzjonijiet differenti ta' L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100 u 125 mg/L) jew Rizolex-T (2, 4, 6, 8 u 10 mg/L), rispettivament. Il-valuri jirrappreżentaw il-medja ± SD ta' ħames repliki bijoloġiċi (n = 5). Ittri differenti jindikaw differenzi statistiċi bejn it-trattamenti (p < 0.05). (D, E) Analiżi ta' rigressjoni tal-mudell probit ta' L-ornithine u l-funġiċida kummerċjali Rizolex-T, rispettivament. Il-linja ta' rigressjoni tal-mudell probit hija murija bħala linja blu solida, u l-intervall ta' kunfidenza (95%) huwa muri bħala linja ħamra bit-tikek.
Barra minn hekk, twettqet analiżi ta' rigressjoni probit u l-plotts korrispondenti huma murija fit-Tabella 1 u l-Figuri 2D,E. Fil-qosor, il-valur aċċettabbli tal-inklinazzjoni (y = 2.92x − 4.67) u l-istatistika sinifikanti assoċjata (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 u p < 0.0001; Figura 2D) ta' L-ornithine indikaw attività antifungali msaħħa kontra S. sclerotiorum meta mqabbla mal-funġiċida kummerċjali Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 u p < 0.0001) (Tabella 1).
Tabella 1. Valuri ta' nofs il-konċentrazzjoni inibitorja massima (IC50) u IC99 (mg/l) ta' L-ornithine u l-funġiċida kummerċjali "Rizolex-T" kontra S. sclerotiorum.
B'mod ġenerali, L-ornithine (250 mg/L) naqqas b'mod sinifikanti l-iżvilupp u s-severità tal-moffa bajda fuq pjanti tal-fażola komuni ttrattati meta mqabbla ma' pjanti infettati b'S. sclerotiorum mhux ittrattati (kontroll; Figura 3A). Fil-qosor, għalkemm is-severità tal-marda tal-pjanti ta' kontroll infettati mhux ittrattati żdiedet gradwalment (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, u 92.33 ± 3.06%), L-ornithine naqqas b'mod sinifikanti s-severità tal-marda (%) matul l-esperiment (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, u 26.36 ± 3.07) wara 7, 14, u 21 jum wara t-trattament (dpt), rispettivament (Figura 3A). Bl-istess mod, meta pjanti tal-fażola infettati b'S. sclerotiorum ġew ittrattati b'250 mg/L L-ornithine, l-erja taħt il-kurva tal-progressjoni tal-marda (AUDPC) naqset minn 1274.33 ± 33.13 fil-kontroll mhux trattat għal 281.03 ± 7.95, li kienet kemxejn inqas minn dik tal-kontroll pożittiv 50 mg/L funġiċida Rizolex-T (183.61 ± 7.71; Fig. 3B). L-istess xejra ġiet osservata fit-tieni esperiment.
Fig. 3. Effett tal-applikazzjoni eżoġena ta' L-ornithine fuq l-iżvilupp tat-taħsir abjad tal-fażola komuni kkawżat minn Sclerotinia sclerotiorum taħt kundizzjonijiet ta' serra. (A) Kurva tal-progressjoni tal-marda tal-moffa bajda tal-fażola komuni wara trattament b'250 mg/L L-ornithine. (B) Żona taħt il-kurva tal-progressjoni tal-marda (AUDPC) tal-moffa bajda tal-fażola komuni wara trattament b'L-ornithine. Il-valuri jirrappreżentaw il-medja ± SD ta' ħames repliki bijoloġiċi (n = 5). Ittri differenti jindikaw differenzi statistikament sinifikanti bejn it-trattamenti (p < 0.05).
L-applikazzjoni eżoġena ta' 250 mg/L L-ornithine żiedet gradwalment l-għoli tal-pjanta (Fig. 4A), in-numru ta' friegħi għal kull pjanta (Fig. 4B), u n-numru ta' weraq għal kull pjanta (Fig. 4C) wara 42 jum. Filwaqt li l-funġiċida kummerċjali Rizolex-T (50 mg/L) kellu l-akbar effett fuq il-parametri nutrizzjonali kollha studjati, l-applikazzjoni eżoġena ta' 250 mg/L L-ornithine kellha t-tieni l-akbar effett meta mqabbla mal-kontrolli mhux ittrattati (Figs. 4A–C). Min-naħa l-oħra, it-trattament b'L-ornithine ma kellu l-ebda effett sinifikanti fuq il-kontenut tal-pigmenti fotosintetiċi klorofilla a (Fig. 4D) u klorofilla b (Fig. 4E), iżda żied xi ftit il-kontenut totali ta' karotenojdi (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) meta mqabbel mal-kontroll negattiv (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) u l-kontroll pożittiv (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; Fig. 4F). B'mod ġenerali, dawn ir-riżultati jindikaw li L-ornithine mhuwiex fitotossiku għal-legumi ttrattati u jista' saħansitra jistimula t-tkabbir tagħhom.
Fig. 4. Effett tal-applikazzjoni eżoġena ta' L-ornithine fuq il-karatteristiċi tat-tkabbir u l-pigmenti fotosintetiċi tal-weraq tal-fażola infettati bi Sclerotinia sclerotiorum f'kundizzjonijiet ta' serra. (A) Għoli tal-pjanta (cm), (B) Numru ta' friegħi għal kull pjanta, (C) Numru ta' weraq għal kull pjanta, (D) Kontenut ta' klorofilla a (mg g-1 fr wt), (E) Kontenut ta' klorofilla b (mg g-1 fr wt), (F) Kontenut totali ta' karotenojdi (mg g-1 fr wt). Il-valuri huma l-medja ± SD ta' ħames repliki bijoloġiċi (n = 5). Ittri differenti jindikaw differenzi statistikament sinifikanti bejn it-trattamenti (p < 0.05).
Lokalizzazzjoni istokimika in situ ta' speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS; espressi bħala perossidu tal-idroġenu [H2O2]) u radikali ħielsa (espressi bħala anjoni superossidu [O2•−]) żvelat li l-applikazzjoni eżoġena ta' L-ornithine (250 mg/L) naqqset b'mod sinifikanti l-akkumulazzjoni ta' H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) u O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) meta mqabbla mal-akkumulazzjoni kemm ta' pjanti infettati mhux ittrattati (173.31 ± 12.06 u 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW, rispettivament) kif ukoll ta' pjanti ttrattati b'50 mg/L tal-funġiċida kummerċjali Rizolex-T (170.12 ± 9.50 u 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, rispettivament) wara 72 siegħa. Livelli għoljin ta' H2O2 u O2•− akkumulaw taħt hpt (Fig. 5A, B). Bl-istess mod, l-analiżi tal-malondialdehyde (MDA) ibbażata fuq it-TCA wriet li l-pjanti tal-fażola infettati b'S. sclerotiorum akkumulaw livelli ogħla ta' MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) fil-weraq tagħhom (Fig. 5C). Madankollu, l-applikazzjoni eżoġena ta' L-ornithine naqqset b'mod sinifikanti l-perossidazzjoni tal-lipidi kif evidenzjat mit-tnaqqis fil-kontenut ta' MDA fil-pjanti ttrattati (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Effett tal-applikazzjoni eżoġena ta' L-ornithine fuq markaturi ewlenin ta' stress ossidattiv u mekkaniżmi ta' difiża antiossidanti mhux enżimatiċi fil-weraq tal-fażola infettati b'S. sclerotiorum 72 siegħa wara l-infezzjoni taħt kundizzjonijiet ta' serra. (A) Perossidu tal-idroġenu (H2O2; nmol g−1 FW) f'72 hpt, (B) anjon superossidu (O2•−; nmol g−1 FW) f'72 hpt, (C) malondialdejde (MDA; nmol g−1 FW) f'72 hpt, (D) fenoli totali solubbli (mg GAE g−1 FW) f'72 hpt, (E) flavonojdi totali solubbli (mg RE g−1 FW) f'72 hpt, (F) aċidi amminiċi ħielsa totali (mg g−1 FW) f'72 hpt, u ​​(G) kontenut ta' prolina (mg g−1 FW) f'72 hpt. Il-valuri jirrappreżentaw il-medja ± devjazzjoni standard (medja ± SD) ta' 5 repliki bijoloġiċi (n = 5). Ittri differenti jindikaw differenzi statistikament sinifikanti bejn it-trattamenti (p < 0.05).