Aħna diġà rrappurtajna li l-livelli fis-serum tal-metabolit tat-triptofan derivat mill-imsaren indole-3-propionic acid (IPA) huma aktar baxxi f'pazjenti b'fibrożi tal-fwied. F'dan l-istudju, investigajna t-traskrittoma u l-metiloma tad-DNA fil-fwied obeż fir-rigward tal-livelli tas-serum tal-IPA, kif ukoll ir-rwol tal-IPA fl-induzzjoni tal-inattivazzjoni fenotipika taċ-ċelloli stellati epatiċi (HSCs) in vitro.
L-istudju inkluda 116-il pazjent obeż mingħajr dijabete mellitus tat-tip 2 (T2DM) (età 46.8 ± 9.3 snin; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) li għaddew minn kirurġija barjatrika fiċ-Ċentru tal-Kirurġija Barjatrika ta' Kuopio (KOBS). Il-livelli ta' IPA fiċ-ċirkolazzjoni tkejlu permezz ta' kromatografija likwida-spettrometrija tal-massa (LC-MS), analiżi tat-traskrittoma tal-fwied twettqet permezz ta' sekwenzar totali tal-RNA, u analiżi tal-metilazzjoni tad-DNA twettqet bl-użu tal-Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Ċelloli stellati epatiċi umani (LX-2) intużaw għal esperimenti in vitro.
Il-livelli ta' IPA fis-serum kienu korrelati mal-espressjoni ta' ġeni involuti f'mogħdijiet apoptotiċi, mitofaġiċi, u ta' lonġevità fil-fwied. Il-ġene AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) kien l-aktar ġene abbundanti u dominanti li jinteraġixxi fit-traskrizzjoni tal-fwied u l-profili tal-metilazzjoni tad-DNA. It-trattament bl-IPA wassal għal apoptożi, naqqas ir-respirazzjoni mitokondrijali, u biddel il-morfoloġija taċ-ċelluli u d-dinamika mitokondrijali billi jimmodula l-espressjoni ta' ġeni magħrufa li jirregolaw il-fibrożi, l-apoptożi, u s-sopravivenza taċ-ċelluli LX-2.
Meħuda flimkien, din id-dejta tappoġġja li l-IPA għandu effetti terapewtiċi potenzjali u jista' jikkaġuna apoptożi u jbiddel il-fenotip tal-HSC lejn stat inattiv, u b'hekk tespandi l-possibbiltà li tinibixxi l-fibrożi tal-fwied billi tinterferixxi mal-attivazzjoni tal-HSC u l-metaboliżmu mitokondrijali.
Il-prevalenza tal-obeżità u s-sindromu metaboliku ġiet assoċjata ma' inċidenza dejjem tiżdied ta' marda tal-fwied xaħmi assoċjata metabolikament (MASLD); il-marda taffettwa minn 25% sa 30% tal-popolazzjoni ġenerali [1]. Il-konsegwenza ewlenija tal-etjoloġija tal-MASLD hija l-fibrożi tal-fwied, proċess dinamiku kkaratterizzat minn akkumulazzjoni kontinwa ta' matriċi extraċellulari fibruża (ECM) [2]. Iċ-ċelloli ewlenin involuti fil-fibrożi tal-fwied huma ċelloli stellati epatiċi (HSCs), li juru erba' fenotipi magħrufa: kwiexxenti, attivati, inattivati, u senexxenti [3, 4]. L-HSCs jistgħu jiġu attivati ​​u jittrasdifferenzjaw minn forma kwiexxenti f'ċelloli proliferattivi simili għal fibroblasti b'domanda għolja ta' enerġija, b'espressjoni akbar ta' α-smooth muscle actin (α-SMA) u collagen tat-tip I (Col-I) [5, 6]. Matul it-treġġigħ lura tal-fibrożi tal-fwied, l-HSCs attivati ​​jiġu eliminati permezz ta' apoptożi jew inattivazzjoni. Dawn il-proċessi jinkludu tnaqqis fir-regolazzjoni tal-ġeni fibroġeniċi u modulazzjoni tal-ġeni tal-prosopravivenza (bħal mogħdijiet ta' sinjalazzjoni NF-κB u PI3K/Akt) [7, 8], kif ukoll bidliet fid-dinamika u l-funzjoni mitokondrijali [9].
Il-livelli fis-serum tal-metabolit tat-triptofan indole-3-propionic acid (IPA), prodott fl-imsaren, instabu li huma mnaqqsa f'mard metaboliku uman inkluż MASLD [10–13]. L-IPA huwa assoċjat mal-konsum tal-fibra tad-dieta, huwa magħruf għall-effetti antiossidanti u anti-infjammatorji tiegħu, u jnaqqas il-fenotip tal-isteatoepatite mhux alkoħolika (NASH) indotta mid-dieta in vivo u in vitro [11–14]. Xi evidenza ġejja mill-istudju preċedenti tagħna, li wera li l-livelli fis-serum tal-IPA kienu aktar baxxi f'pazjenti b'fibrożi tal-fwied milli f'pazjenti obeżi mingħajr fibrożi tal-fwied fl-Istudju tal-Kuopio Bariatric Surgery (KOBS). Barra minn hekk, wrejna li t-trattament bl-IPA jista' jnaqqas l-espressjoni ta' ġeni li huma markaturi klassiċi tal-adeżjoni taċ-ċelluli, il-migrazzjoni taċ-ċelluli u l-attivazzjoni taċ-ċelluli staminali ematopojetiċi f'mudell ta' ċellula stellata epatika umana (LX-2) u huwa metabolit epatoprotettiv potenzjali [15]. Madankollu, għadu mhux ċar kif l-IPA jikkaġuna rigressjoni tal-fibrożi tal-fwied billi jattiva l-apoptożi tal-HSC u l-bijoenerġetika mitokondrijali.
Hawnhekk, nuru li l-IPA fis-serum huwa assoċjat mal-espressjoni ta' ġeni arrikkiti fl-apoptożi, il-mitofaġija, u l-mogħdijiet tal-lonġevità fil-fwied ta' individwi obeżi iżda mhux bid-dijabete tat-tip 2 (KOBS). Barra minn hekk, sibna li l-IPA jista' jikkaġuna t-tneħħija u d-degradazzjoni taċ-ċelloli staminali ematopojetiċi attivati ​​(HSCs) permezz tal-mogħdija tal-inattivazzjoni. Dawn ir-riżultati jiżvelaw rwol ġdid għall-IPA, li jagħmilha mira terapewtika potenzjali biex tippromwovi r-rigressjoni tal-fibrożi tal-fwied.
Studju preċedenti fil-koorti KOBS wera li pazjenti b'fibrożi tal-fwied kellhom livelli aktar baxxi ta' IPA fiċ-ċirkolazzjoni meta mqabbla ma' pazjenti mingħajr fibrożi tal-fwied [15]. Biex neskludu l-effett potenzjali ta' konfużjoni tad-dijabete tat-tip 2, irreklutajna 116-il pazjent obeż mingħajr dijabete tat-tip 2 (età medja ± SD: 46.8 ± 9.3 snin; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (Tabella 1) mill-istudju KOBS li għadu għaddej bħala l-popolazzjoni tal-istudju [16]. Il-parteċipanti kollha taw kunsens infurmat bil-miktub u l-protokoll tal-istudju ġie approvat mill-Kumitat tal-Etika tal-Isptar tal-Kontea ta' North Savo skont id-Dikjarazzjoni ta' Helsinki (54/2005, 104/2008 u 27/2010).
Kampjuni ta' bijopsija tal-fwied inkisbu waqt kirurġija barjatrika u ġew evalwati istoloġikament minn patoloġisti b'esperjenza skont kriterji deskritti qabel [17, 18]. Il-kriterji ta' valutazzjoni huma miġbura fil-qosor fit-Tabella Supplimentari S1 u ġew deskritti qabel [19].
Kampjuni tas-serum waqt is-sawm ġew analizzati permezz ta' kromatografija likwida mhux immirata-spettrometrija tal-massa (LC-MS) għall-analiżi metabolomika (n = 116). Il-kampjuni ġew analizzati bl-użu ta' sistema UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, il-Ġermanja) kif deskritt qabel19. L-identifikazzjoni tal-alkoħol isopropiliku (IPA) kienet ibbażata fuq il-ħin ta' żamma u t-tqabbil tal-ispettru MS/MS ma' standards puri. L-intensità tas-sinjal tal-IPA (erja tal-quċċata) ġiet ikkunsidrata fl-analiżijiet ulterjuri kollha [20].
Is-sekwenzar tal-RNA tal-fwied sħiħ twettaq bl-użu tal-Illumina HiSeq 2500 u d-dejta ġiet ipproċessata minn qabel kif deskritt qabel [19, 21, 22]. Aħna wettaqna analiżi mmirata tal-espressjoni differenzjali tat-traskrizzjonijiet li jaffettwaw il-funzjoni mitokondrijali/bijoġenesi bl-użu ta' 1957 ġene magħżula mid-database MitoMiner 4.0 [23]. L-analiżi tal-metilazzjoni tad-DNA tal-fwied twettqet bl-użu tal-Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) bl-istess metodoloġija kif deskritta qabel [24, 25].
Ċelloli stellati epatiċi umani (LX-2) ġew ġentilment ipprovduti mill-Prof. Stefano Romeo u ġew ikkultivati ​​u miżmuma f'mezz DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Biex tintgħażel id-doża tax-xogħol tal-IPA, iċ-ċelloli LX-2 ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' IPA (10 μM, 100 μM u 1 mM; Sigma, 220027) f'mezz DMEM/F12 għal 24 siegħa. Barra minn hekk, biex tiġi investigata l-abbiltà tal-IPA li jinattiva l-HSCs, iċ-ċelloli LX-2 ġew ittrattati flimkien ma' 5 ng/ml TGF-β1 (sistemi R&D, 240-B-002/CF) u 1 mM IPA f'mezz mingħajr serum għal 24 siegħa. Għall-kontrolli tal-vettura korrispondenti, 4 nM HCL li fih 0.1% BSA intuża għat-trattament TGF-β1 u 0.05% DMSO intuża għat-trattament IPA, u t-tnejn intużaw flimkien għat-trattament ikkombinat.
L-apoptożi ġiet ivvalutata bl-użu tal-FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit b'7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Fil-qosor, LX-2 (1 × 105 ċelluli/bir) ġew ikkultivati ​​matul il-lejl fi pjanċi ta' 12-il bir u mbagħad ittrattati b'dożi multipli ta' IPA jew IPA u TGF-β1. L-għada, iċ-ċelluli f'wiċċ l-ilma u aderenti nġabru, ġew tripsinizzati, maħsula bil-PBS, sospiżi mill-ġdid f'buffer li jorbot l-Annexin V, u inkubati b'FITC-Annexin V u 7-AAD għal 15-il minuta.
Il-mitokondrija fiċ-ċelloli ħajjin ġiet imtebbgħa għall-attività ossidattiva bl-użu ta' Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Għall-assaġġi tal-MTR, iċ-ċelloli LX-2 ġew inkubati f'densitajiet ugwali ma' IPA u TGF-β1. Wara 24 siegħa, iċ-ċelloli ħajjin ġew tripsinizzati, maħsula bil-PBS, u mbagħad inkubati b'100 μM MTR f'mezz ħieles mis-serum f'temperatura ta' 37 °C għal 20 minuta kif deskritt qabel [26]. Għall-analiżi tal-morfoloġija taċ-ċelloli ħajjin, id-daqs taċ-ċelloli u l-kumplessità ċitoplasmika ġew analizzati bl-użu tal-parametri forward scatter (FSC) u side scatter (SSC), rispettivament.
Id-dejta kollha (30,000 avveniment) inkisbet bl-użu ta' NovoCyte Quanteon (Agilent) u ġiet analizzata bl-użu tas-softwer NovoExpress® 1.4.1 jew FlowJo V.10.
Ir-rata tal-konsum tal-ossiġnu (OCR) u r-rata tal-aċidifikazzjoni extraċellulari (ECAR) tkejlu f'ħin reali bl-użu ta' Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) mgħammar b'Seahorse XF Cell Mito Stress skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Fil-qosor, 2 × 104 ċelluli LX-2/bir ġew miżrugħa fuq pjanċi tal-kultura taċ-ċelluli XF96. Wara inkubazzjoni matul il-lejl, iċ-ċelluli ġew ittrattati b'isopropanol (IPA) u TGF-β1 (Metodi Supplimentari 1). L-analiżi tad-dejta twettqet bl-użu tas-softwer Seahorse XF Wave, li jinkludi s-Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. Minn dan, ġie kkalkulat Bioenergetic Health Index (BHI) [27].
L-RNA totali ġie traskritt f'cDNA. Għal metodi speċifiċi, ara r-referenza [15]. Il-livelli ta' mRNA tal-proteina aċiduża ribosomali umana 60S P0 (RPLP0) u taċ-ċiklofilina A1 (PPIA) intużaw bħala kontrolli kostituttivi tal-ġeni. Is-Sistema QuantStudio 6 pro Real-Time PCR (Thermo Fisher, Landsmeer, l-Olanda) intużat mat-TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) jew is-Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), u l-ħin relattiv tal-espressjoni tal-ġeni ġie kkalkulat bl-użu ta' parametri komparattivi taċ-ċikliżmu tal-valur Ct (ΔΔCt) u l-metodu ∆∆Ct. Id-dettalji tal-primers huma pprovduti fit-Tabelli Supplimentari S2 u S3.
Id-DNA nukleari (ncDNA) u d-DNA mitokondrijali (mtDNA) ġew estratti bl-użu tal-kit tad-demm u t-tessuti DNeasy (Qiagen) kif deskritt qabel [28]. L-ammont relattiv ta' mtDNA ġie kkalkulat billi ġie kkalkulat il-proporzjon ta' kull reġjun fil-mira tal-mtDNA għall-medja ġeometrika tat-tliet reġjuni tad-DNA nukleari (mtDNA/ncDNA), kif iddettaljat fil-Metodi Supplimentari 2. Id-dettalji tal-primers għall-mtDNA u l-ncDNA huma pprovduti fit-Tabella Supplimentari S4.
Iċ-ċelloli ħajjin ġew imtebbgħin b'Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) biex jiġu viżwalizzati n-netwerks mitokondrijali interċellulari u intraċellulari. Iċ-ċelloli LX-2 (1 × 104 ċelloli/bir) ġew ikkultivati ​​fuq slajds tal-ħġieġ fi pjanċi tal-kultura b'qiegħ tal-ħġieġ korrispondenti (Ibidi GmbH, Martinsried, il-Ġermanja). Wara 24 siegħa, iċ-ċelloli LX-2 ħajjin ġew inkubati b'100 μM MTR għal 20 minuta f'temperatura ta' 37 °C u n-nuklei taċ-ċelloli ġew imtebbgħin b'DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) kif deskritt qabel [29]. In-netwerks mitokondrijali ġew viżwalizzati bl-użu ta' mikroskopju invertit Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, il-Ġermanja) mgħammar b'modulu konfokali Zeiss LSM 800 f'temperatura ta' 37 °C f'atmosfera umidifikata b'5% CO2 bl-użu ta' oġġettiv 63×NA 1.3. Ksibna għaxar immaġini tas-serje Z għal kull tip ta' kampjun. Kull serje Z fiha 30 sezzjoni, kull waħda bi ħxuna ta' 9.86 μm. Għal kull kampjun, inkisbu immaġnijiet ta' għaxar kampi viżivi differenti bl-użu tas-softwer ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, il-Ġermanja), u twettqet analiżi tal-morfoloġija mitokondrijali bl-użu tas-softwer ImageJ (v1.54d) [30, 31] skont il-parametri dettaljati fil-Metodi Supplimentari 3.
Iċ-ċelloli ġew iffissati b'2% glutaraldehyde f'0.1 M phosphate buffer, segwit minn fissazzjoni b'soluzzjoni ta' 1% osmium tetroxide (Sigma Aldrich, MO, USA), deidratati gradwalment bl-aċetun (Merck, Darmstadt, il-Ġermanja), u finalment inkorporati f'reżina epossidika. Sezzjonijiet ultrarqaq ġew ippreparati u mtebbgħin b'1% uranyl acetate (Merck, Darmstadt, il-Ġermanja) u 1% lead citrate (Merck, Darmstadt, il-Ġermanja). Immaġni ultrastrutturali nkisbu bl-użu ta' mikroskopju elettroniku ta' trasmissjoni JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, il-Ġappun) b'vultaġġ ta' aċċelerazzjoni ta' 80 kV.
Il-morfoloġija taċ-ċelloli LX-2 ittrattati bl-IPA għal 24 siegħa ġiet analizzata permezz ta' mikroskopija b'kuntrast ta' fażi b'ingrandiment ta' 50x bl-użu ta' mikroskopju tad-dawl invertit Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 u AxioCam MRm, Jena, il-Ġermanja).
Id-dejta klinika ġiet espressa bħala medja ± devjazzjoni standard jew medjana (firxa interkwartili: IQR). Intużat analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda (varjabbli kontinwi) jew test χ² (varjabbli kategoriċi) biex jitqabblu d-differenzi bejn it-tliet gruppi ta' studju. Ir-rata falza pożittiva (FDR) intużat biex tikkoreġi għal testijiet multipli, u ġeni b'FDR < 0.05 tqiesu statistikament sinifikanti. L-analiżi tal-korrelazzjoni ta' Spearman intużat biex tikkorrelata l-metilazzjoni tad-DNA CpG mal-intensità tas-sinjal tal-IPA, b'valuri p nominali (p < 0.05) irrappurtati.
L-analiżi tal-mogħdija twettqet bl-użu ta' għodda ta' analiżi ta' sett ta' ġeni bbażata fuq il-web (WebGestalt) għal 268 traskrizzjoni (p nominali < 0.01), 119-il traskrizzjoni assoċjata mal-mitokondrija (p nominali < 0.05), u 4350 CpG minn 3093 traskrizzjoni tal-fwied li kienu assoċjati mal-livelli ta' IPA fis-serum li jiċċirkolaw. L-għodda Venny DB (verżjoni 2.1.0) disponibbli bla ħlas intużat biex issib ġeni li jikkoinċidu, u StringDB (verżjoni 11.5) intużat biex tivviżwalizza l-interazzjonijiet bejn proteina u proteina.
Għall-esperiment LX-2, il-kampjuni ġew ittestjati għan-normalità bl-użu tat-test D'Agostino-Pearson. Id-dejta nkisbet minn mill-inqas tliet repliki bijoloġiċi u ġiet soġġetta għal ANOVA f'direzzjoni waħda bit-test Bonferroni post hoc. Valur p ta' inqas minn 0.05 kien ikkunsidrat statistikament sinifikanti. Id-dejta hija ppreżentata bħala medja ± SD, u n-numru ta' esperimenti huwa indikat f'kull figura. L-analiżijiet u l-graffs kollha twettqu bl-użu tas-softwer statistiku GraphPad Prism 8 għall-Windows (GraphPad Software Inc., verżjoni 8.4.3, San Diego, USA).
L-ewwel, investigajna l-assoċjazzjoni tal-livelli ta' IPA fis-serum mat-traskrizzjonijiet tal-fwied, tal-ġisem kollu, u mitokondrijali. Fil-profil tat-traskrizzjoni totali, l-aktar ġene b'saħħtu assoċjat mal-livelli ta' IPA fis-serum kien MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 3); fil-profil tat-traskrizzjoni relatat mal-mitokondrija, l-aktar ġene assoċjat b'saħħtu kien AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serine/threonine kinase 1) (Fajl Addizzjonali 1 u Fajl Addizzjonali 2).
Imbagħad analizzajna t-traskrizzjonijiet globali (n = 268; p < 0.01) u t-traskrizzjonijiet assoċjati mal-mitokondrija (n = 119; p < 0.05), u fl-aħħar mill-aħħar identifikajna l-apoptożi bħala l-aktar mogħdija kanonika sinifikanti (p = 0.0089). Għat-traskrizzjonijiet mitokondrijali assoċjati mal-livelli ta' IPA fis-serum, iffukajna fuq l-apoptożi (FDR = 0.00001), il-mitofaġija (FDR = 0.00029), u l-mogħdijiet tas-sinjalar TNF (FDR = 0.000006) (Figura 1A, Tabella 2, u Figuri Supplimentari 1A-B).
Analiżi li jikkoinċidu ta' traskrizzjonijiet globali, assoċjati mal-mitokondrija, u metilazzjoni tad-DNA fil-fwied tal-bniedem f'assoċjazzjoni mal-livelli tas-serum IPA. A tirrappreżenta 268 traskrizzjoni globali, 119-il traskrizzjoni assoċjati mal-mitokondrija, u traskrizzjonijiet metilati tad-DNA li huma mmappjati għal 3092 sit CpG assoċjati mal-livelli tas-serum IPA (valuri p < 0.01 għal traskrizzjonijiet globali u DNA metilat, u valuri p < 0.05 għal traskrizzjonijiet mitokondrijali). It-traskrizzjonijiet ewlenin li jikkoinċidu huma murija fin-nofs (AKT1 u YKT6). B Il-mappa ta' interazzjoni tat-13-il ġene bl-ogħla punteġġ ta' interazzjoni (0.900) ma' ġeni oħra nbniet mill-56 ġene li jikkoinċidu (reġjun tal-linja sewda) li kienu assoċjati b'mod sinifikanti mal-livelli tas-serum IPA bl-użu tal-għodda online StringDB. Aħdar: Ġeni mmappjati għall-komponent ċellulari tal-Ontoloġija tal-Ġeni (GO): mitokondrija (GO:0005739). AKT1 hija l-proteina bl-ogħla punteġġ (0.900) għal interazzjonijiet ma' proteini oħra bbażati fuq id-dejta (ibbażata fuq it-tħaffir tat-test, esperimenti, databases, u ko-espressjoni). In-nodi tan-netwerk jirrappreżentaw il-proteini, u t-truf jirrappreżentaw konnessjonijiet bejn il-proteini.
Peress li l-metaboliti tal-mikrobijota tal-imsaren jistgħu jirregolaw il-kompożizzjoni epiġenetika permezz tal-metilazzjoni tad-DNA [32], investigajna jekk il-livelli tal-IPA fis-serum kinux assoċjati mal-metilazzjoni tad-DNA tal-fwied. Sibna li ż-żewġ siti ewlenin ta' metilazzjoni assoċjati mal-livelli tal-IPA fis-serum kienu qrib ir-reġjun 3 rikk fil-prolina-serina (C19orf55) u l-membru 6 (żgħir) tal-familja tal-proteini tax-xokk tas-sħana B (HSPB6) (Fajl addizzjonali 3). Il-metilazzjoni tad-DNA ta' 4350 CpG (p < 0.01) kienet korrelata mal-livelli tal-IPA fis-serum u kienet arrikkita fil-mogħdijiet regolatorji tal-lonġevità (p = 0.006) (Figura 1A, Tabella 2, u Figura Supplimentari 1C).
Biex nifhmu l-mekkaniżmi bijoloġiċi li fuqhom huma bbażati l-assoċjazzjonijiet bejn il-livelli ta' IPA fis-serum, it-traskrizzjonijiet globali, it-traskrizzjonijiet assoċjati mal-mitokondrija, u l-metilazzjoni tad-DNA fil-fwied tal-bniedem, wettaqna analiżi ta' sovrappożizzjoni tal-ġeni identifikati fl-analiżi preċedenti tal-mogħdija (Figura 1A). Ir-riżultati tal-analiżi tal-arrikkiment tal-mogħdija tal-56 ġene li jikkoinċidu (ġewwa l-linja sewda fil-Figura 1A) urew li l-mogħdija tal-apoptożi (p = 0.00029) enfasizzat żewġ ġeni komuni għat-tliet analiżijiet: AKT1 u YKT6 (omologu YKT6 v-SNARE), kif muri fid-dijagramma ta' Venn (Figura Supplimentari 2 u Figura 1A). Interessanti, sibna li AKT1 (cg19831386) u YKT6 (cg24161647) kienu korrelati b'mod pożittiv mal-livelli ta' IPA fis-serum (Fajl Addizzjonali 3). Biex nidentifikaw interazzjonijiet potenzjali ta' proteini bejn prodotti tal-ġeni, għażilna 13-il ġene bl-ogħla punteġġ ta' reġjun komuni (0.900) fost 56 ġene li jikkoinċidu bħala input u bnejna mappa ta' interazzjoni. Skont il-livell ta' kunfidenza (kunfidenza marġinali), il-ġene AKT1 bl-ogħla punteġġ (0.900) kien fil-quċċata (Figura 1B).
Abbażi tal-analiżi tal-mogħdija, sibna li l-apoptożi kienet il-mogħdija ewlenija, għalhekk investigajna jekk it-trattament bl-IPA kienx se jaffettwa l-apoptożi tal-HSCs in vitro. Preċedentement wrejna li dożi differenti ta' IPA (10 μM, 100 μM, u 1 mM) ma kinux tossiċi għaċ-ċelloli LX-2 [15]. Dan l-istudju wera li t-trattament bl-IPA f'10 μM u 100 μM żied in-numru ta' ċelloli vijabbli u nekrotiċi. Madankollu, meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll, il-vijabbiltà taċ-ċelloli naqset f'konċentrazzjoni ta' 1 mM IPA, filwaqt li r-rata tan-nekrożi taċ-ċelloli baqgħet l-istess (Figura 2A, B). Imbagħad, biex insibu l-konċentrazzjoni ottimali biex tinduċi apoptożi fiċ-ċelloli LX-2, ittestjajna 10 μM, 100 μM, u 1 mM IPA għal 24 siegħa (Figura 2A-E u Figura Supplimentari 3A-B). Interessanti, IPA 10 μM u 100 μM naqqsu r-rata ta' apoptożi (%), madankollu, IPA 1 mM żied l-apoptożi tard u r-rata ta' apoptożi (%) meta mqabbel mal-kontroll u għalhekk intgħażel għal aktar esperimenti (Figuri 2A–D).
L-IPA jikkaġuna apoptożi taċ-ċelloli LX-2. Il-metodu ta' tebgħa doppja ta' Annexin V u 7-AAD intuża biex jikkwantifika r-rata apoptotika u l-morfoloġija taċ-ċelloli permezz ta' ċitometrija tal-fluss. Iċ-ċelloli BA ġew inkubati b'10 μM, 100 μM u 1 mM IPA għal 24 siegħa jew b'F–H TGF-β1 (5 ng/ml) u 1 mM IPA f'mezz ħieles mis-serum għal 24 siegħa. A: ċelloli ħajjin (Annexin V -/ 7AAD-); B: ċelloli nekrotiċi (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: bikri (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: tard (Annexin V+/7AAD.+); E, H: perċentwal ta' ċelloli apoptotiċi bikrija u tard totali f'rata apoptotika (%). Id-dejta hija espressa bħala medja ± SD, n = 3 esperimenti indipendenti. It-tqabbil statistiku sar bl-użu ta' ANOVA f'direzzjoni waħda bit-test post hoc ta' Bonferroni. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Kif wrejna qabel, 5 ng/ml TGF-β1 jista' jinduċi l-attivazzjoni tal-HSC billi jżid l-espressjoni tal-ġeni markaturi klassiċi [15]. Iċ-ċelloli LX-2 ġew ittrattati b'5 ng/ml TGF-β1 u 1 mM IPA flimkien (Fig. 2E–H). It-trattament b'TGF-β1 ma biddilx ir-rata tal-apoptożi, madankollu, it-trattament flimkien mal-IPA żied l-apoptożi tard u r-rata tal-apoptożi (%) meta mqabbel mat-trattament b'TGF-β1 (Fig. 2E–H). Dawn ir-riżultati jindikaw li 1 mM IPA jista' jippromwovi l-apoptożi fiċ-ċelloli LX-2 indipendentement mill-induzzjoni ta' TGF-β1.
Investigajna aktar l-effett tal-IPA fuq ir-respirazzjoni mitokondrijali fiċ-ċelloli LX-2. Ir-riżultati wrew li 1 mM IPA naqqas il-parametri tar-rata tal-konsum tal-ossiġnu (OCR): respirazzjoni mhux mitokondrijali, respirazzjoni bażali u massimali, tnixxija tal-protoni u produzzjoni tal-ATP meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll (Figura 3A, B), filwaqt li l-indiċi tas-saħħa bijoenerġetika (BHI) ma nbidilx.
L-IPA jnaqqas ir-respirazzjoni mitokondrijali fiċ-ċelloli LX-2. Il-kurva tar-respirazzjoni mitokondrijali (OCR) hija ppreżentata bħala parametri tar-respirazzjoni mitokondrijali (respirazzjoni mhux mitokondrijali, respirazzjoni bażali, respirazzjoni massima, tnixxija ta' protoni, ġenerazzjoni ta' ATP, SRC u BHI). Iċ-ċelloli A u B ġew inkubati b'10 μM, 100 μM u 1 mM IPA għal 24 siegħa, rispettivament. Iċ-ċelloli C u D ġew inkubati b'TGF-β1 (5 ng/ml) u 1 mM IPA f'mezz ħieles mis-serum għal 24 siegħa, rispettivament. Il-kejl kollu ġie normalizzat għall-kontenut tad-DNA bl-użu tal-kit CyQuant. BHI: indiċi tas-saħħa bijoenerġetika; SRC: kapaċità ta' riżerva respiratorja; OCR: rata ta' konsum tal-ossiġnu. Id-dejta hija ppreżentata bħala medja ± devjazzjoni standard (SD), n = 5 esperimenti indipendenti. It-tqabbil statistiku sar bl-użu ta' ANOVA f'direzzjoni waħda u test post hoc ta' Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; u ***p < 0.001
Biex niksbu fehim aktar komprensiv tal-effett tal-IPA fuq il-profil bijoenerġetiku taċ-ċelloli LX-2 attivati ​​minn TGF-β1, analizzajna l-fosforilazzjoni ossidattiva mitokondrijali permezz tal-OCR (Fig. 3C,D). Ir-riżultati wrew li t-trattament b'TGF-β1 seta' jnaqqas ir-respirazzjoni massima, il-kapaċità ta' riżerva respiratorja (SRC) u l-BHI meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll (Fig. 3C,D). Barra minn hekk, it-trattament ikkombinat naqqas ir-respirazzjoni bażali, it-tnixxija tal-protoni u l-produzzjoni tal-ATP, iżda l-SRC u l-BHI kienu sinifikament ogħla minn dawk ittrattati b'TGF-β1 (Fig. 3C,D).
Aħna wettaqna wkoll it-“Test tal-Fenotip tal-Enerġija Ċellulari” pprovdut mis-softwer Seahorse (Fig. Supplimentari 4A–D). Kif muri fil-Fig. Supplimentari 3B, kemm il-potenzjal metaboliku tal-OCR kif ukoll tal-ECAR naqas wara t-trattament b’TGF-β1, madankollu, ma ġiet osservata l-ebda differenza fil-gruppi ta’ trattament ikkombinat u IPA meta mqabbla mal-grupp ta’ kontroll. Barra minn hekk, kemm il-livelli bażali kif ukoll dawk ta’ stress tal-OCR naqsu wara t-trattament ikkombinat u IPA meta mqabbla mal-grupp ta’ kontroll (Fig. Supplimentari 4C). Interessanti, ġie osservat xejra simili bit-terapija ikkombinata, fejn ma ġiet osservata l-ebda bidla fil-livelli bażali u ta’ stress tal-ECAR meta mqabbla mat-trattament b’TGF-β1 (Fig. Supplimentari 4C). Fl-HSCs, it-tnaqqis fil-fosforilazzjoni ossidattiva mitokondrijali u l-abbiltà tat-trattament ikkombinat li jirrestawra SCR u BHI wara l-espożizzjoni għat-trattament b’TGF-β1 ma biddlux il-potenzjal metaboliku (OCR u ECAR). Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati jindikaw li l-IPA jista' jnaqqas il-bijoenerġetika fl-HSCs, u dan jissuġġerixxi li l-IPA jista' jikkaġuna profil enerġetiku aktar baxx li jbiddel il-fenotip tal-HSC lejn l-inattivazzjoni (Figura Supplimentari 4D).
L-effett tal-IPA fuq id-dinamika mitokondrijali ġie investigat bl-użu ta' kwantifikazzjoni tridimensjonali tal-morfoloġija mitokondrijali u l-konnessjonijiet tan-netwerk kif ukoll it-tbajja' tal-MTR (Figura 4 u Figura Supplimentari 5). Il-Figura 4 turi li, meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll, it-trattament b'TGF-β1 naqqas l-erja medja tal-wiċċ, in-numru ta' fergħat, it-tul totali tal-fergħat, u n-numru ta' ġunzjonijiet tal-fergħat (Figura 4A u B) u biddel il-proporzjon tal-mitokondrija minn morfoloġija sferika għal intermedja (Figura 4C). It-trattament bl-IPA biss naqqas il-volum mitokondrijali medju u biddel il-proporzjon tal-mitokondrija minn morfoloġija sferika għal intermedja meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll (Figura 4A). B'kuntrast, l-isferiċità, it-tul medju tal-fergħat, u l-attività mitokondrijali vvalutati mill-MTR dipendenti fuq il-potenzjal tal-membrana mitokondrijali (Figura 4A u E) baqgħu l-istess u dawn il-parametri ma kinux differenti bejn il-gruppi. Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li t-trattament b'TGF-β1 u IPA jidhru li jimmodulaw il-forma u d-daqs mitokondrijali kif ukoll il-kumplessità tan-netwerk fiċ-ċelloli LX-2 ħajjin.
L-IPA jibdel id-dinamika mitokondrijali u l-abbundanza tad-DNA mitokondrijali fiċ-ċelloli LX-2. A. Stampi konfokali rappreżentattivi ta' ċelloli LX-2 ħajjin inkubati b'TGF-β1 (5 ng/ml) u 1 mM IPA għal 24 siegħa f'mezz ħieles mis-serum li juru netwerks mitokondrijali mtebbgħin b'Mitotracker™ Red CMXRos u nuklei mtebbgħin blu b'DAPI. Id-dejta kollha kien fiha mill-inqas 15-il immaġni għal kull grupp. Akkwistajna 10 immaġni Z-stack għal kull tip ta' kampjun. Kull sekwenza tal-assi Z kien fiha 30 porzjon, kull waħda bi ħxuna ta' 9.86 μm. Skala bar: 10 μm. B. Oġġetti rappreżentattivi (mitokondrija biss) identifikati bl-applikazzjoni ta' limitu adattiv għall-immaġni. Analiżi kwantitattiva u tqabbil tal-konnessjonijiet tan-netwerk morfoloġiċi mitokondrijali twettqu għaċ-ċelloli kollha f'kull grupp. C. Frekwenza tal-proporzjonijiet tal-forma mitokondrijali. Valuri qrib 0 jindikaw forom sferiċi, u valuri qrib 1 jindikaw forom filamentożi. D Il-kontenut tad-DNA mitokondrijali (mtDNA) ġie determinat kif deskritt fil-Materjali u l-Metodi. L-analiżi ta' E Mitotracker™ Red CMXRos twettqet permezz ta' ċitometrija tal-fluss (30,000 avveniment) kif deskritt f'Materjali u Metodi. Id-dejta hija ppreżentata bħala medja ± SD, n = 3 esperimenti indipendenti. It-tqabbil statistiku sar bl-użu ta' ANOVA f'direzzjoni waħda u t-test post hoc ta' Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Imbagħad analizzajna l-kontenut tal-mtDNA fiċ-ċelloli LX-2 bħala indikatur tan-numru mitokondrijali. Meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll, il-kontenut tal-mtDNA żdied fil-grupp ittrattat b'TGF-β1 (Figura 4D). Meta mqabbel mal-grupp ittrattat b'TGF-β1, il-kontenut tal-mtDNA tnaqqas fil-grupp ta' trattament kombinat (Figura 4D), li jissuġġerixxi li l-IPA jista' jnaqqas il-kontenut tal-mtDNA u possibbilment in-numru mitokondrijali kif ukoll ir-respirazzjoni mitokondrijali (Figura 3C). Barra minn hekk, l-IPA deher li jnaqqas il-kontenut tal-mtDNA fit-trattament kombinat iżda ma affettwax l-attività mitokondrijali medjata mill-MTR (Figuri 4A–C).
Investigajna l-assoċjazzjoni tal-IPA mal-livelli ta' mRNA ta' ġeni assoċjati mal-fibrożi, l-apoptożi, is-sopravivenza, u d-dinamika mitokondrijali fiċ-ċelloli LX-2 (Figura 5A–D). Meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll, il-grupp ittrattat b'TGF-β1 wera żieda fl-espressjoni ta' ġeni bħal collagen type I α2 chain (COL1A2), α-smooth muscle actin (αSMA), matrix metalloproteinase 2 (MMP2), tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP1), u dynamin 1-like gene (DRP1), li jindika żieda fil-fibrożi u l-attivazzjoni. Barra minn hekk, meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll, it-trattament b'TGF-β1 naqqas il-livelli ta' mRNA tar-riċettur nuclear pregnane X (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, inibitur ta' B-cell α, enhancer of nuclear factor κ gene light peptide (NFκB1A), u inibitur ta' nuclear factor κB kinase subunit β (IKBKB) (Figura 5A–D). Meta mqabbel mat-trattament b'TGF-β1, it-trattament ikkombinat b'TGF-β1 u IPA naqqas l-espressjoni ta' COL1A2 u MMP2, iżda żied il-livelli ta' mRNA ta' PXR, TIMP1, limfoma taċ-ċelluli B-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, u IKBKB. It-trattament bl-IPA naqqas b'mod sinifikanti l-espressjoni ta' MMP2, proteina X assoċjata ma' Bcl-2 (BAX), AKT1, proteina tal-atrofija ottika 1 (OPA1), u proteina tal-fużjoni mitokondrijali 2 (MFN2), filwaqt li l-espressjoni ta' CASP8, NFκB1A, NFκB1B, u IKBKB żdiedet meta mqabbla mal-grupp ta' kontroll. Madankollu, ma nstabet l-ebda differenza fl-espressjoni ta' caspase-3 (CASP3), apoptotic peptidase activating factor 1 (APAF1), mitokondrijali fusion protein 1 (MFN1), u fission protein 1 (FIS1). Kollettivament, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li t-trattament bl-IPA jimmodula l-espressjoni ta' ġeni assoċjati mal-fibrożi, l-apoptożi, is-sopravivenza, u d-dinamika mitokondrijali. Id-dejta tagħna tissuġġerixxi li t-trattament bl-IPA jnaqqas il-fibrożi fiċ-ċelloli LX-2; fl-istess ħin, jistimula s-sopravivenza billi jbiddel il-fenotip lejn l-inattivazzjoni.
L-IPA jimmodula l-espressjoni tal-ġeni tal-fibroblasti, apoptotiċi, tal-vijabbiltà, u tad-dinamika mitokondrijali fiċ-ċelloli LX-2. L-istogrammi juru l-espressjoni tal-mRNA relattiva għall-kontroll endoġenu (RPLP0 jew PPIA) wara li ċ-ċelloli LX-2 ġew indotti b'TGF-β1 u IPA f'mezz ħieles mis-serum għal 24 siegħa. A tindika fibroblasti, B tindika ċelloli apoptotiċi, C tindika ċelloli superstiti, u D tindika l-espressjoni tal-ġeni tad-dinamika mitokondrijali. Id-dejta hija ppreżentata bħala medja ± devjazzjoni standard (SD), n = 3 esperimenti indipendenti. It-tqabbil statistiku sar bl-użu ta' ANOVA f'direzzjoni waħda u t-test post hoc ta' Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Imbagħad, il-bidliet fid-daqs taċ-ċelluli (FSC-H) u l-kumplessità ċitoplasmika (SSC-H) ġew ivvalutati permezz ta' ċitometrija tal-fluss (Figura 6A,B), u l-bidliet fil-morfoloġija taċ-ċelluli wara t-trattament bl-IPA ġew ivvalutati permezz ta' mikroskopija elettronika ta' trasmissjoni (TEM) u mikroskopija ta' kuntrast tal-fażi (Figura Supplimentari 6A-B). Kif mistenni, iċ-ċelluli fil-grupp ittrattat b'TGF-β1 żdiedu fid-daqs meta mqabbla mal-grupp ta' kontroll (Figura 6A,B), u dan juri l-espansjoni klassika tar-retikulu endoplasmiku mhux maħdum (ER*) u l-fagolisosomi (P), li jindika l-attivazzjoni taċ-ċelluli staminali ematopojetiċi (HSC) (Figura Supplimentari 6A). Madankollu, meta mqabbla mal-grupp ittrattat b'TGF-β1, id-daqs taċ-ċelluli, il-kumplessità ċitoplasmika (Fig. 6A,B), u l-kontenut ta' ER* tnaqqsu fil-grupp ta' trattament kombinat ta' TGF-β1 u IPA (Figura Supplimentari 6A). Barra minn hekk, it-trattament bl-IPA naqqas id-daqs taċ-ċelluli, il-kumplessità ċitoplasmika (Figuri 6A,B), il-kontenut ta' P u ER* (Fig. Supplimentari 6A) meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll. Barra minn hekk, il-kontenut ta' ċelluli apoptotiċi żdied wara 24 siegħa ta' trattament bl-IPA meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll (vleġeġ bojod, Fig. Supplimentari 6B). Kollettivament, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li 1 mM IPA jista' jistimula l-apoptożi tal-HSC u jreġġa' lura l-bidliet fil-parametri morfoloġiċi taċ-ċelluli kkaġunati minn TGF-β1, u b'hekk jirregola d-daqs u l-kumplessità taċ-ċelluli, li jistgħu jkunu assoċjati mal-inattivazzjoni tal-HSC.
L-IPA jibdel id-daqs taċ-ċelluli u l-kumplessità ċitoplasmika fiċ-ċelluli LX-2. Stampi rappreżentattivi tal-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss. L-analiżi użat strateġija ta' gating speċifika għaċ-ċelluli LX-2: SSC-A/FSC-A biex tiddefinixxi l-popolazzjoni taċ-ċelluli, FSC-H/FSC-A biex tidentifika d-doppjetti, u SSC-H/FSC-H għad-daqs taċ-ċelluli u l-analiżi tal-kumplessità. Iċ-ċelluli ġew inkubati b'TGF-β1 (5 ng/ml) u 1 mM IPA f'mezz ħieles mis-serum għal 24 siegħa. Iċ-ċelluli LX-2 ġew imqassma fil-kwadrant t'isfel tax-xellug (SSC-H-/FSC-H-), il-kwadrant t'isfel tal-lemin (SSC-H-/FSC-H+), u l-kwadrant ta' fuq tal-lemin (SSC-H+/FSC-H+) għad-daqs taċ-ċelluli u l-analiżi tal-kumplessità ċitoplasmika. B. Il-morfoloġija taċ-ċelluli ġiet analizzata permezz ta' ċitometrija tal-fluss bl-użu ta' FSC-H (forward scatter, daqs taċ-ċelluli) u SSC-H (side scatter, kumplessità ċitoplasmika) (30,000 avveniment). Id-dejta hija ppreżentata bħala medja ± SD, n = 3 esperimenti indipendenti. It-tqabbil statistiku sar bl-użu ta' ANOVA f'direzzjoni waħda u t-test Bonferroni post hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 u ****p < 0.0001
Metaboliti tal-imsaren bħall-IPA saru suġġett jaħraq ta’ riċerka, u dan jissuġġerixxi li jistgħu jiġu skoperti miri ġodda fil-mikrobijota tal-imsaren. Għalhekk huwa interessanti li l-IPA, metabolit li rrabtajna mal-fibrożi tal-fwied fil-bnedmin [15], intwera li huwa kompost anti-fibrotiku potenzjali f’mudelli tal-annimali [13, 14]. Hawnhekk, nuru għall-ewwel darba assoċjazzjoni bejn l-IPA fis-serum u t-traskrittomika globali tal-fwied u l-metilazzjoni tad-DNA f’individwi obeżi mingħajr dijabete tat-tip 2 (T2D), u nenfasizzaw l-apoptożi, il-mitofaġija u l-lonġevità, kif ukoll ġene kandidat possibbli AKT1 li jirregola l-omeostażi tal-fwied. Novità oħra tal-istudju tagħna hija li wrejna l-interazzjoni tat-trattament bl-IPA mal-apoptożi, il-morfoloġija taċ-ċelluli, il-bijoenerġetika mitokondrijali u d-dinamika fiċ-ċelluli LX-2, li jindika spettru ta’ enerġija aktar baxx li jbiddel il-fenotip HSC lejn l-inattivazzjoni, u jagħmel l-IPA kandidat potenzjali għat-titjib tal-fibrożi tal-fwied.
Sibna li l-apoptożi, il-mitofaġija u l-lonġevità kienu l-aktar mogħdijiet kanoniċi importanti arrikkiti fil-ġeni tal-fwied assoċjati ma' IPA fis-serum li jiċċirkola. It-tfixkil tas-sistema ta' kontroll tal-kwalità mitokondrijali (MQC) jista' jwassal għal disfunzjoni mitokondrijali, mitofaġija u apoptożi, u b'hekk jippromwovi l-okkorrenza ta' MASLD [33, 34]. Għalhekk, nistgħu nispekulaw li l-IPA jista' jkun involut fiż-żamma tad-dinamika taċ-ċelluli u l-integrità mitokondrijali permezz tal-apoptożi, il-mitofaġija u l-lonġevità fil-fwied. Id-dejta tagħna wriet li żewġ ġeni kienu komuni fit-tliet assays: YKT6 u AKT1. Ta' min jinnota li YKT6 hija proteina SNARE involuta fil-proċess tal-fużjoni tal-membrana taċ-ċelluli. Għandha rwol fl-awtofaġija u l-mitofaġija billi tifforma kumpless ta' inizjazzjoni ma' STX17 u SNAP29 fuq l-awtofagosoma, u b'hekk tippromwovi l-fużjoni ta' awtofagosomi u lisosomi [35]. Barra minn hekk, it-telf tal-funzjoni YKT6 jirriżulta f'mitofaġija indebolita[36], filwaqt li r-regolazzjoni 'l fuq ta' YKT6 hija assoċjata mal-progressjoni tal-karċinoma epatoċellulari (HCC), li turi żieda fis-sopravivenza taċ-ċelluli[37]. Min-naħa l-oħra, AKT1 huwa l-aktar ġene importanti li jinteraġixxi u għandu rwol importanti fil-mard tal-fwied, inkluż il-mogħdija tas-sinjalar PI3K/AKT, iċ-ċiklu taċ-ċelluli, il-migrazzjoni taċ-ċelluli, il-proliferazzjoni, l-adeżjoni fokali, il-funzjoni mitokondrijali, u s-sekrezzjoni tal-kollaġen[38–40]. Il-mogħdija tas-sinjalar PI3K/AKT attivata tista' tattiva ċ-ċelluli staminali ematopojetiċi (HSCs), li huma ċ-ċelluli responsabbli għall-produzzjoni tal-matriċi extraċellulari (ECM), u d-disregolazzjoni tagħha tista' tikkontribwixxi għall-okkorrenza u l-progressjoni tal-fibrożi tal-fwied[40]. Barra minn hekk, AKT huwa wieħed mill-fatturi ewlenin tas-sopravivenza taċ-ċelluli li jinibixxi l-apoptożi taċ-ċelluli dipendenti fuq p53, u l-attivazzjoni ta' AKT tista' tkun assoċjata mal-inibizzjoni tal-apoptożi taċ-ċelluli tal-fwied[41, 42]. Ir-riżultati miksuba jissuġġerixxu li l-IPA jista' jkun involut fl-apoptożi assoċjata mal-mitokondrija tal-fwied billi jaffettwa d-deċiżjoni tal-epatoċiti bejn id-dħul fl-apoptożi jew is-sopravivenza. Dawn l-effetti jistgħu jiġu regolati mill-ġeni kandidati AKT u/jew YKT6, li huma kritiċi għall-omeostażi tal-fwied.
Ir-riżultati tagħna wrew li 1 mM IPA wassal għal apoptożi u tnaqqis fir-respirazzjoni mitokondrijali fiċ-ċelloli LX-2 indipendentement mit-trattament b'TGF-β1. Ta' min jinnota li l-apoptożi hija mogħdija ewlenija għar-riżoluzzjoni tal-fibrożi u l-attivazzjoni taċ-ċelloli staminali ematopojetiċi (HSC), u hija wkoll avveniment ewlieni fir-rispons fiżjoloġiku riversibbli tal-fibrożi tal-fwied [4, 43]. Barra minn hekk, ir-restawr tal-BHI fiċ-ċelloli LX-2 wara trattament kombinat ipprovda għarfien ġdid dwar ir-rwol potenzjali tal-IPA fir-regolazzjoni tal-bijoenerġetika mitokondrijali. Taħt kundizzjonijiet ta' mistrieħ u inattivi, iċ-ċelloli ematopojetiċi normalment jużaw il-fosforilazzjoni ossidattiva mitokondrijali biex jipproduċu ATP u jkollhom attività metabolika baxxa. Min-naħa l-oħra, l-attivazzjoni tal-HSC ittejjeb ir-respirazzjoni mitokondrijali u l-bijosintesi biex tikkumpensa għad-domandi tal-enerġija tad-dħul fl-istat glikolitiku [44]. Il-fatt li l-IPA ma affettwax il-potenzjal metaboliku u l-ECAR jissuġġerixxi li l-mogħdija glikolitika hija inqas prijoritizzata. Bl-istess mod, studju ieħor wera li 1 mM IPA kien kapaċi jimmodula l-attività tal-katina respiratorja mitokondrijali fil-kardjomijoċiti, il-linja taċ-ċelluli tal-epatoċiti umani (Huh7) u ċ-ċelluli endoteljali tal-vina umbilikali umana (HUVEC); Madankollu, ma nstab l-ebda effett tal-IPA fuq il-glikoliżi fil-kardjomijoċiti, li jissuġġerixxi li l-IPA jista' jaffettwa l-bijoenerġetika ta' tipi oħra ta' ċelluli [45]. Għalhekk, nissuspettaw li 1 mM IPA jista' jaġixxi bħala diżakkoppjatur kimiku ħafif, peress li jista' jnaqqas b'mod sinifikanti l-espressjoni tal-ġeni fibroġeniċi, il-morfoloġija taċ-ċelluli u l-bijoenerġetika mitokondrijali mingħajr ma jibdel l-ammont ta' mtDNA [46]. Id-diżakkoppjaturi mitokondrijali jistgħu jinibixxu l-fibrożi indotta mill-kultura u l-attivazzjoni tal-HSC [47] u jnaqqsu l-produzzjoni mitokondrijali tal-ATP regolata jew indotta minn ċerti proteini bħal proteini ta' diżakkoppjament (UCP) jew adenine nucleotide translocase (ANT). Skont it-tip ta' ċellula, dan il-fenomenu jista' jipproteġi ċ-ċelluli mill-apoptożi u/jew jippromwovi l-apoptożi [46]. Madankollu, huma meħtieġa aktar studji biex jiġi ċċarat ir-rwol tal-IPA bħala diżakkoppjatur mitokondrijali fl-inattivazzjoni taċ-ċelloli staminali ematopojetiċi.
Imbagħad investigajna jekk il-bidliet fir-respirazzjoni mitokondrijali humiex riflessi fil-morfoloġija mitokondrijali fiċ-ċelloli LX-2 ħajjin. Interessanti, it-trattament b'TGF-β1 jibdel il-proporzjon mitokondrijali minn sferiku għal intermedju, bi tnaqqis fil-fergħat mitokondrijali u żieda fl-espressjoni ta' DRP1, fattur ewlieni fil-fissjoni mitokondrijali [48]. Barra minn hekk, il-frammentazzjoni mitokondrijali hija assoċjata mal-kumplessità ġenerali tan-netwerk, u t-tranżizzjoni mill-fużjoni għall-fissjoni hija kritika għall-attivazzjoni taċ-ċelloli staminali ematopojetiċi (HSC), filwaqt li l-inibizzjoni tal-fissjoni mitokondrijali twassal għal apoptożi tal-HSC [49]. Għalhekk, ir-riżultati tagħna jindikaw li t-trattament b'TGF-β1 jista' jikkaġuna tnaqqis fil-kumplessità tan-netwerk mitokondrijali bi tnaqqis fil-fergħat, li huwa aktar komuni fil-fissjoni mitokondrijali assoċjata maċ-ċelloli staminali ematopojetiċi attivati ​​(HSCs). Barra minn hekk, id-dejta tagħna wriet li l-IPA jista' jibdel il-proporzjon tal-mitokondrija minn forma sferika għal intermedja, u b'hekk inaqqas l-espressjoni ta' OPA1 u MFN2. Studji wrew li r-regolazzjoni 'l isfel ta' OPA1 tista' tikkawża tnaqqis fil-potenzjal tal-membrana mitokondrijali u twassal għal apoptożi taċ-ċelloli [50]. MFN2 huwa magħruf li jimmedja l-fużjoni mitokondrijali u l-apoptożi [51]. Ir-riżultati miksuba jissuġġerixxu li l-induzzjoni taċ-ċelloli LX-2 minn TGF-β1 u/jew IPA tidher li timmodula l-forma u d-daqs mitokondrijali, kif ukoll l-istat ta' attivazzjoni u l-kumplessità tan-netwerk.
Ir-riżultati tagħna jindikaw li t-trattament ikkombinat ta' TGFβ-1 u IPA jista' jnaqqas l-mtDNA u l-parametri morfoloġiċi taċ-ċelluli billi jirregola l-espressjoni tal-mRNA tal-fibrożi, l-apoptożi u l-ġeni relatati mas-sopravivenza f'ċelloli li jevadu l-apoptożi. Tabilħaqq, l-IPA naqqas il-livell ta' espressjoni tal-mRNA ta' AKT1 u ġeni importanti tal-fibrożi bħal COL1A2 u MMP2, iżda żied il-livell ta' espressjoni ta' CASP8, li huwa assoċjat mal-apoptożi. Ir-riżultati tagħna wrew li wara t-trattament bl-IPA, l-espressjoni tal-BAX naqset u l-espressjoni tal-mRNA tas-subunitajiet tal-familja TIMP1, BCL-2 u NF-κB żdiedet, li jissuġġerixxi li l-IPA jista' jistimula sinjali ta' sopravivenza f'ċelloli staminali ematopojetiċi (HSCs) li jevadu l-apoptożi. Dawn il-molekuli jistgħu jaġixxu bħala sinjali favur is-sopravivenza f'ċelloli staminali ematopojetiċi attivati, li jistgħu jkunu assoċjati ma' żieda fl-espressjoni ta' proteini anti-apoptotiċi (bħal Bcl-2), tnaqqis fl-espressjoni ta' BAX pro-apoptotiku, u interazzjoni kumplessa bejn TIMP u NF-κB [5, 7]. L-IPA jeżerċita l-effetti tiegħu permezz tal-PXR, u sibna li t-trattament ikkombinat ma' TGF-β1 u IPA żied il-livelli ta' espressjoni tal-mRNA tal-PXR, li jindika soppressjoni tal-attivazzjoni tal-HSC. Is-sinjalar tal-PXR attivat huwa magħruf li jinibixxi l-attivazzjoni tal-HSC kemm in vivo kif ukoll in vitro [52, 53]. Ir-riżultati tagħna jindikaw li l-IPA jista' jipparteċipa fit-tneħħija tal-HSCs attivati ​​billi jippromwovi l-apoptożi, inaqqas il-fibrożi u l-metaboliżmu mitokondrijali, u jtejjeb is-sinjali tas-sopravivenza, li huma proċessi tipiċi li jikkonvertu l-fenotip tal-HSC attivat għal wieħed inattivat. Spjegazzjoni oħra possibbli għall-mekkaniżmu potenzjali u r-rwol tal-IPA fl-apoptożi hija li jneħħi l-mitokondrija disfunzjonali primarjament permezz tal-mitofaġija (mogħdija intrinsika) u l-mogħdija tas-sinjalar estrinsika tat-TNF (Tabella 1), li hija marbuta direttament mal-mogħdija tas-sinjalar tas-sopravivenza tal-NF-κB (Figura Supplimentari 7). Interessanti, ġeni arrikkiti relatati mal-IPA huma kapaċi jinduċu sinjali pro-apoptotiċi u pro-sopravivenza fil-mogħdija apoptotika [54], li jissuġġerixxi li l-IPA jista' jinduċi l-mogħdija apoptotika jew is-sopravivenza billi jinteraġixxi ma' dawn il-ġeni. Madankollu, kif l-IPA jinduċi apoptożi jew sopravivenza waqt l-attivazzjoni tal-HSC u l-mogħdijiet mekkanistiċi tiegħu għadhom mhux ċari.
L-IPA huwa metabolit mikrobjali ffurmat minn triptofan tad-dieta permezz tal-mikrobijota tal-imsaren. Studji wrew li għandu proprjetajiet regolatorji anti-infjammatorji, antiossidanti, u epiġenetiċi fl-ambjent intestinali.[55] Studji wrew li l-IPA jista' jimmodula l-funzjoni tal-barriera intestinali u jnaqqas l-istress ossidattiv, li jista' jikkontribwixxi għall-effetti fiżjoloġiċi lokali tiegħu.[56] Fil-fatt, l-IPA jiġi ttrasportat lejn l-organi fil-mira permezz taċ-ċirkolazzjoni, u peress li l-IPA jaqsam struttura ta' metabolit ewlieni simili mad-derivattivi tat-triptofan, is-serotonin, u l-indole, l-IPA jeżerċita azzjonijiet metaboliċi li jirriżultaw f'destin metaboliku kompetittiv.[52] L-IPA jista' jikkompeti ma' metaboliti derivati ​​mit-triptofan għal siti ta' rbit fuq enzimi jew riċetturi, u potenzjalment ifixkel il-mogħdijiet metaboliċi normali. Dan jenfasizza l-ħtieġa għal aktar studji dwar il-farmakokinetika u l-farmakodinamika tiegħu biex nifhmu aħjar it-tieqa terapewtika tiegħu.[57] Għad irridu naraw jekk dan jistax iseħħ ukoll fiċ-ċelloli staminali ematopojetiċi (HSCs).
Nirrikonoxxu li l-istudju tagħna għandu xi limitazzjonijiet. Biex neżaminaw speċifikament l-assoċjazzjonijiet relatati mal-IPA, eskludejna pazjenti bid-dijabete mellitus tat-tip 2 (T2DM). Nirrikonoxxu li dan jillimita l-applikabbiltà wiesgħa tas-sejbiet tagħna għal pazjenti bid-dijabete mellitus tat-tip 2 u mard avvanzat tal-fwied. Għalkemm il-konċentrazzjoni fiżjoloġika tal-IPA fis-serum uman hija 1–10 μM [11, 20], intgħażlet konċentrazzjoni ta' 1 mM IPA bbażata fuq l-ogħla konċentrazzjoni mhux tossika [15] u l-ogħla rata ta' apoptożi, mingħajr ebda differenza fil-perċentwal tal-popolazzjoni taċ-ċelluli nekrotiċi. Għalkemm intużaw livelli suprafiżjoloġiċi tal-IPA f'dan l-istudju, bħalissa m'hemm l-ebda kunsens dwar id-doża effettiva tal-IPA [52]. Għalkemm ir-riżultati tagħna huma sinifikanti, id-destin metaboliku usa' tal-IPA jibqa' qasam attiv ta' riċerka. Barra minn hekk, is-sejbiet tagħna dwar l-assoċjazzjoni bejn il-livelli tal-IPA fis-serum u l-metilazzjoni tad-DNA tat-traskrizzjonijiet tal-fwied inkisbu mhux biss minn ċelluli staminali ematopojetiċi (HSCs) iżda wkoll minn tessuti tal-fwied. Għażilna li nużaw ċelloli LX-2 umani bbażati fuq is-sejbiet preċedenti tagħna mill-analiżi tat-traskrittomi li l-IPA huwa assoċjat mal-attivazzjoni taċ-ċelloli staminali ematopojetiċi (HSC) [15], u l-HSCs huma ċ-ċelloli ewlenin involuti fil-progressjoni tal-fibrożi tal-fwied. Il-fwied huwa magħmul minn diversi tipi ta' ċelloli, għalhekk mudelli oħra ta' ċelloli bħas-sistema ta' ko-kultura taċ-ċelloli immuni epatoċiti-HSC flimkien mal-attivazzjoni tal-caspase u l-frammentazzjoni tad-DNA kif ukoll il-mekkaniżmu ta' azzjoni inkluż il-livell tal-proteina għandhom jiġu kkunsidrati biex jiġi studjat ir-rwol tal-IPA u l-interazzjoni tiegħu ma' tipi oħra ta' ċelloli tal-fwied.