L-issortjar tal-proteini fil-mogħdija sekretorja huwa essenzjali biex tinżamm il-kompartimentalizzazzjoni taċ-ċelluli u l-omeostażi. Minbarra l-issortjar medjat mill-qoxra, ir-rwol tal-lipidi fl-issortjar tal-kinesin fil-proċess tat-trasport sekretorju huwa mistoqsija bażika li ilha teżisti li għadha ma ġietx imwieġba. Hawnhekk, qed inwettqu immaġini 3D simultanji b'riżoluzzjoni għolja b'ħafna kuluri f'ħin reali biex nippruvaw in vivo li proteini immobilizzati bil-glikosilfosfatidilinositol sintetizzati ġodda b'partijiet lipidiċi taċ-ċeramide twal ħafna huma miġbura u kklassifikati f'sit ta' ħruġ nett ta' endoplażmi speċjalizzat, li huwa differenti minn dak użat mill-proteini transmembrana. Barra minn hekk, nuru li t-tul tal-katina taċ-ċeramide fil-membrana tar-retikulu endoplasmiku huwa kritiku għal din is-selettività tal-issortjar. L-istudju tagħna jipprovdi l-ewwel evidenza diretta in vivo biex jiġu kklassifikati l-merkanzija tal-proteini bbażata fuq it-tul tal-katina tal-lipidi f'siti ta' esportazzjoni selettivi fil-mogħdija sekretorja.
Fiċ-ċelloli ewkarjotiċi, il-proteini sintetizzati fir-retikulu endoplasmiku (ER) imbagħad jiġu magħżula waqt it-trasport permezz tal-mogħdija sekretorja għall-kunsinna fid-destinazzjoni ċellulari xierqa tagħhom (1). Minbarra l-issortjar medjat mill-kisja, ilu jiġi spekulat li ċerti lipidi jistgħu jservu wkoll bħala punti ta' ħruġ selettivi billi jinġabru f'dominji speċifiċi tal-membrana li proteini speċifiċi (2-5). Madankollu, għad hemm nuqqas ta' evidenza diretta in vivo biex tipprova dan il-mekkaniżmu possibbli bbażat fuq il-lipidi. Sabiex insolvu din il-problema bażika, studjajna fil-ħmira kif il-proteini ankrati tal-glikosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-APs) huma esportati b'mod differenti mill-ER. Il-GPI-APs huma varjetà ta' proteini tal-wiċċ taċ-ċellula konnessi mal-lipidi (6, 7). Il-GPI-AP hija proteina sekreta mwaħħla mal-fuljetti ta' barra tal-membrana tal-plażma permezz tal-parti glikolipida (ankra GPI). Huma jaċċettaw ankri GPI bħala modifiki post-traduzzjonali konservattivi fil-lumen tal-ER (8). Wara t-twaħħil, il-GPI-AP jgħaddi mill-apparat ta' Golgi (5, 9) mill-ER għall-membrana tal-plażma. Il-preżenza ta' ankri tal-GPI tikkawża li l-GPI-AP jiġi ttrasportat separatament mill-proteini sekretati transmembrana (inklużi proteini oħra tal-membrana tal-plażma) tul il-mogħdija sekretorja (5, 9, 10). Fiċ-ċelloli tal-ħmira, il-GPI-APs huma separati minn proteini sekretati oħra fir-retikulu endoplasmiku, u mbagħad ippakkjati f'vesikoli uniċi mgeżwra minn kumpless ta' proteini tal-kisi II (COPII) (6, 7). Id-determinanti ta' dan il-proċess ta' klassifikazzjoni fil-proċess ta' esportazzjoni tal-ER mhumiex ċari, iżda huwa spekulat li dan il-mekkaniżmu jista' jeħtieġ lipidi, speċjalment ir-rimudellar strutturali tal-porzjon lipidiku tal-ankra tal-GPI (5, 8). Fil-ħmira, ir-rimudellar tal-lipidi tal-GPI jibda immedjatament wara li l-GPI jeħel, u f'ħafna każijiet, jikkawża li ċ-ċeramide torbot mal-aċidu xaħmi saturat b'katina twila ta' 26 karbonju (C26:0) (11, 12). Iċ-ċeramide C26 hija ċ-ċeramide ewlenija prodotta miċ-ċelloli tal-ħmira s'issa. Din hija sintetizzata fl-ER u l-biċċa l-kbira minnha hija esportata lejn l-apparat Golgi permezz ta' vesikuli COPII (13). L-esportazzjoni tal-GPI-AP fl-ER teħtieġ speċifikament sinteżi kontinwa taċ-ċeramide (14, 15), u min-naħa tagħha, il-konverżjoni taċ-ċeramide għal ċeramide tal-inositol fosfat (IPC) fl-apparat Golgi tiddependi fuq is-sintesi tal-ankra GPI (16). Studji bijofiżiċi b'membrani artifiċjali wrew li ċeramidi b'katina aċilika twila ħafna jistgħu jingħaqdu biex jiffurmaw dominji ordnati bi proprjetajiet fiżiċi uniċi (17, 18). Din id-dejta twassal għall-ipoteżi li ċ-ċeramide C26 u l-GPI-AP maċ-ċeramide C26 jużaw il-proprjetajiet fiżiċi tagħhom biex jingħaqdu f'reġjuni ordnati jew reġjuni fl-ambjent lipidiku tal-membrana tal-ER relattivament imbarazzat. Hija magħmula prinċipalment minn gliċerolipidi qosra u mhux saturati (C16:1 u C18:1) (19, 20). Dawn ir-reġjuni se jkunu ffukati b'mod selettiv fuq siti speċifiċi ta' ħruġ mill-ER (ERES), fejn iċ-ċeramide u l-GPI-AP ibbażat fuq iċ-ċeramide jistgħu jiġu ttrasportati flimkien lejn il-Golgi fl-istess vesikula COPII dedikata (5).
F'dan l-istudju, ittestjajna direttament dan il-mekkaniżmu bbażat fuq il-lipidi billi użajna mikroskopija tal-immaġini konfokali f'ħin reali b'riżoluzzjoni għolja (SCLIM), li hija teknika ta' mikroskopija avvanzata li tista' tosserva simultanjament proteini mmarkati b'mod fluworexxenti. L-immaġini bi tliet kuluri u tridimensjonali (3D) għandhom riżoluzzjoni u veloċità estremament għolja fiċ-ċelloli ħajjin (21, 22).
L-ewwel applikajna t-teknoloġija SCLIM biex niddefinixxu aktar kif il-GPI-AP normali bil-grupp taċ-ċeramide C26 ġie skrinjat minn proteini sekretati transmembrana wara li ħalla l-ER f'S. cerevisiae. Sabiex nivverifikaw il-klassifikazzjoni tal-ER, użajna sistema ġenetika li tista' tivviżwalizza direttament merkanzija sintetizzata ġdida li tidħol fl-ERES in vivo (7, 23). Bħala merkanzija, għażilna GPI-AP Gas1 ibbażat fuq iċ-ċeramide C26 immarkat bil-proteina fluworexxenti ħadra (GFP) u l-proteina sekretata transmembrana Mid2 immarkata bil-proteina fluworexxenti qrib l-infra-aħmar (iRFP), li t-tnejn jimmiraw lejn il-membrana tal-plażma (24–26). Fil-mutant sensittiv għat-temperatura sec31-1, dawn iż-żewġ tagħbijiet huma espressi taħt promotur induċibbli mill-galattożju u markatur ERES kostituttiv. F'temperatura estrema (37°C), minħabba li l-mutazzjoni sec31-1 taffettwa l-funzjoni tal-komponent tal-kisi COPII Sec31 li jinibixxi l-ġerminazzjoni COPII u l-esportazzjoni tal-ER, merkanzija sintetizzata ġdida takkumula fl-ER (23). Wara li tkessħu għal temperatura baxxa (24°C), iċ-ċelloli mutanti sec31-1 irkupraw miż-żona sekretorja, u l-merkanzija sintetika ġdida akkumulata bdiet tiġi esportata mill-ER. Il-viżwalizzazzjoni CLIM uriet li l-biċċa l-kbira tal-Gas1-GFP u Mid2-iRFP sintetizzati ġodda xorta akkumulaw fl-ER taċ-ċelloli mutanti sec31-1 wara l-inkubazzjoni f'37°C u mbagħad rilaxxati f'24°C għal 5 minuti (Figura 1). Peress li Mid2-iRFP huwa mqassam fuq il-membrana ER kollha, u Gas1-GFP huwa kkonċentrat u miġbur fiż-żona diskontinwa tal-membrana ER, id-distribuzzjoni tagħhom hija kompletament differenti (Figura 1, A sa C u Film S1). Barra minn hekk, kif muri fil-Figura 1D, il-grupp Gas1-GFP m'għandux Mid2-iRFP. Dawn ir-riżultati jindikaw li l-proteini GPI-AP u transmembrana ġew separati f'reġjuni differenti tal-membrana ER kmieni. Il-grupp Gas1-GFP huwa biswit ERES speċifiku mmarkat bil-proteina tal-kisi COPII ta' mCherry Sec13 (Figura 1, E u F, u l-film S1) (23).
Iċ-ċelloli sec31-1 jesprimu sekrezzjonijiet indotti mill-galattożju, ċeramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, aħdar) b'katina twila ta' aċil (C26) u l-proteina transmembrana Mid2-iRFP (TMP, blu) u dan it-tikkettar ERES Kostruttiv Sec13-mCherry (ERES, maġenta) ġie inkubat f'temperatura ta' 37°C għal 30 minuta, imċaqlaq għal 24°C, u immaġini permezz ta' SCLIM 5 minuti wara. (A sa C) turi immaġni 2D magħquda jew waħda rappreżentattiva ta' pjan (A), immaġni ta' projezzjoni 2D ta' 10 z-sezzjonijiet (B) jew immaġni 3D ta' emisfera taċ-ċellula tal-merkanzija u markaturi ERES (C). Skala ta' 1μm (A u B). L-unità tal-iskala hija 0.551μm (C). Gas1-GFP ġie skopert f'reġjuni jew gruppi diskreti tal-ER, filwaqt li Mid2-iRFP ġie skopert u mqassam mal-membrana tal-ER kollha (C). (D) Il-graff juri l-intensità relattiva tal-fluworexxenza ta' Gas1-GFP u Mid2-iRFP fil-grupp Gas1-GFP tul il-linja tal-vleġġa bajda (xellug). AU, unità arbitrarja. (E u F) jirrappreżentaw l-immaġni 3D li tgħaqqad il-marka tal-oġġetti u tal-ERES. Il-gruppi ta' Gas1-GFP instabu ħdejn l-ERES speċifiku. L-unità tal-iskala hija 0.551μm. (F) Il-vleġġa bajda solida timmarka l-grupp Gas1-GFP assoċjat mal-ERES. Il-pannelli tan-nofs u tal-lemin juru l-immaġni 3D imkabbra magħquda u veduta mdawwra tal-grupp Gas1-GFP magħżul.
Ir-relazzjoni spazjali mill-qrib bejn il-grupp Gas1-GFP u ERES speċifiku tindika li Gas1-GFP jista' jidħol f'ERES selettiv, li huwa differenti mis-selettività użata minn Mid2-iRFP biex joħroġ mill-ER. Biex nindirizzaw din il-possibbiltà, ikkwantifikajna l-proporzjon tal-ERES għal oġġett wieħed jew tnejn biss (Figura 2, A sa C). Sibna li l-biċċa l-kbira tal-ERES (70%) fihom tip wieħed biss ta' merkanzija. L-immaġni tal-qiegħ tal-Figura 2C turi żewġ eżempji tipiċi ta' ERES b'Gas1-GFP biss (Figura 1) jew Mid2-iRFP biss (Figura 2). B'kuntrast, madwar 20% tal-ERES fihom żewġ tagħbijiet li jikkoinċidu fl-istess żona. Instab li xi ERES (10%) kien fihom żewġ tipi ta' merkanzija, iżda kienu iżolati f'żoni ċarament differenti. Għalhekk, din l-analiżi statistika turi li wara li l-ER jiġi esportat, GPI-AP Gas1-GFP u l-merkanzija transmembrana Mid2-iRFP huma maqsuma f'ERES differenti (Figura 2D). Din l-effiċjenza tal-issortjar hija konsistenti ħafna mal-analiżi bijokimika preċedenti (6) u d-determinazzjoni morfoloġika (7). Nistgħu nosservaw ukoll l-imġiba tal-merkanzija fi kwarantina li tidħol fl-ERES (Figura 2E u Film S2). Il-Figura 2E turi li porzjon żgħir biss ta' Gas1-GFP (pannell 3) jew Mid2-iRFP (pannell 4) jidħol fl-ERES minn naħa waħda u huwa kkonfinat f'żona diskreta. Il-Panel 5 tal-Figura 2E juri li Gas1-GFP u Mid2-iRFP xi kultant jinstabu fl-istess ERES, iżda jidħlu minn naħat differenti u huma kkonċentrati f'reġjuni separati li jistgħu jirrappreżentaw vesikoli COPII differenti. Ikkonfermajna wkoll li s-separazzjoni u l-klassifikazzjoni osservata ta' GPI-AP Gas1 ibbażat fuq iċ-ċeramide C26 bħala ERES selettiv hija speċifika minħabba li merkanzija oħra ta' sekrezzjoni transmembrana, il-proteina tal-membrana tal-plażma Axl2 (27) immarkata bil-GFP, li turi mġiba simili għal Mid2-iRFP. (Stampa S1 u Film S3). L-Axl2-GFP sintetizzat ġdid huwa mqassam permezz tal-membrana tal-ER bħal Mid2-iRFP (Figura S1, A u B), u huwa ko-lokalizzat ma' Mid2-iRFP fil-biċċa l-kbira tal-ERES (Figura S1, B sa D). Il-Panels 1 u 2 tal-Figura 1. S1C juru żewġ eżempji tipiċi ta' ERES fejn żewġ tagħbijiet transmembrana jikkoinċidu. F'dawn il-każijiet, iż-żewġ oġġetti jidħlu fl-ERES flimkien (Figura S1E, Panel 3 u Film S3).
Iċ-ċelloli sec31-1 li jesprimu sekrezzjonijiet induċibbli tal-galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, aħdar) u Mid2-iRFP (TMP, blu) u t-tikkettar ERES kostituttiv Sec13-mCherry (ERES, maġenta) tqiegħdu fi 37. Wara inkubazzjoni għal 30 minuta f'°C, mexxi għal 24 °C biex tirrilaxxa l-blokk tas-sekrezzjoni, u ħu immaġni b'SCLIM wara 20 minuta. (A sa C) Stampi rappreżentattivi ta' projezzjoni 2D (A; skala bar, 1μm) jew immaġni 3D tal-emisfera taċ-ċelloli (B u C; unità tal-iskala, 0.456μm) tal-merkanzija u 10 sezzjonijiet z immarkati b'ERES. Il-pannell t'isfel f'(B) u l-pannell f'(C) juru immaġni pproċessati biex juru biss l-oġġetti preżenti fl-ERES (maġenta) [Gas1-GFP (griż) u Mid2-iRFP (blu ċar)]. (C) Vleġġa miftuħa: L-ERES iġorr biss biċċa merkanzija waħda (1 sa 4). Vleġġa griża: L-ERES fiha merkanzija segregata (5). Vleġġa bajda solida: ERES fiha merkanzija ko-lokata. Hawn taħt: L-ERES uniku magħżul fih biss Gas1-GFP (1) jew Mid2-iRFP (2). Skala tal-bar, 100 nm. (D) Kwantifikazzjoni tal-fotomikrografu deskritt f'(C). Il-perċentwal medju ta' ERES li fih biss merkanzija waħda (Gas1-GFP jew Mid2-iRFP), merkanzija segregata u merkanzija li tikkoinċidi. Fi tliet esperimenti indipendenti, n=432 f'54 ċellula. Bar tal-iżball = SD. Test t mhux imqabbel b'żewġ dnub. *** P = 0.0002. (E) Immaġni 3D ta' ERES magħżula ta' merkanzija kwarantinata mmarkata b'(C). Gas1-GFP (aħdar) (3) jew Mid2-iRFP (blu) (4) jidħol fl-ERES (maġenta) minn naħa waħda u huwa ristrett għal żona żgħira fi ħdan l-ERES. Xi kultant, iż-żewġ tipi ta’ merkanzija jidħlu fl-istess ERES (5) mill-istess naħa u jkunu limitati għal żona iżolata fi ħdan l-ERES. Skala, 100 nm.
Sussegwentement, ittestjajna ipoteżi li ċ-ċeramide b'katina twila ta' aċil (C26) preżenti fil-membrana tal-ER tmexxi l-ikklassifikar u l-issortjar speċifiku ta' Gas1 f'ERES selettiv. Għal dan il-għan, użajna razza ta' ħmira modifikata GhLag1, fejn iż-żewġ sintasi ta' ċeramide endoġeni Lag1 u Lac1 ġew sostitwiti minn GhLag1 (l-omologu Lag1 tal-qoton), li rriżulta f'razza ta' ħmira b'razza ta' Ceramide b'membrana taċ-ċellula iqsar mit-tip selvaġġ (Figura 3A) (28). L-analiżi tal-ispettrometrija tal-massa (MS) uriet li fir-razez tat-tip selvaġġ, 95% taċ-ċeramide totali hija ċeramide b'katina twila ħafna (C26), filwaqt li f'GhLag1, 85% taċ-ċeramide hija twila ħafna (C18 u C16). ), 2% biss taċ-ċeramide hija ċeramide b'katina twila ħafna (C26). Għalkemm iċ-ċeramidi C18 u C16 huma ċ-ċeramidi ewlenin li nstabu fil-membrana GhLag1 s'issa, l-analiżi MS ikkonfermat ukoll li l-ankra GPI ta' Gas1-GFP espressa fir-razza GhLag1 fiha ċeramide C26, li hija komparabbli mal-lipidi tat-tip selvaġġ. Il-kwalità hija l-istess (Fig. 3A) (26). Għalhekk, dan ifisser li l-enzima tar-rimudellar taċ-ċeramide Cwh43 hija selettiva ħafna għaċ-ċeramide C26, kif muri fil-Figura 26, tinkorpora preferenzjalment l-ankra GPI minn ammont żgħir ta' ċeramide C26 fir-razza GhLag1. S2 (29). Madankollu, il-membrana taċ-ċellula ta' GhLag1 bażikament fiha biss ċeramide C18-C16, filwaqt li Gas1-GFP xorta għandha ċeramide C26. Dan il-fatt jagħmel din ir-razza għodda ideali biex issolvi speċifikament il-problema tat-tul tal-katina aċilika taċ-ċeramide tal-membrana fl-ER. Ir-rwol ipotetiku tal-klassi u l-issortjar. Imbagħad, l-ewwel studjajna l-abbiltà ta' C26 Gas1-GFP li jakkumula fi gruppi f'GhLag1 b'allel mutant sensittiv għat-temperatura ta' sec31-1 permezz ta' mikroskopija ta' fluworexxenza konvenzjonali, fejn teżisti biss il-katina twila (C18-C16) fil-membrana ER Ceramide (Fig. 3). Osservajna li f'sec31-1, il-biċċa l-kbira ta' Gas1-GFP kienet ikkonċentrata fi gruppi, filwaqt li Gas1-GFP f'sec31-1 GhLag1 b'membrana ER ceramide twila (C18-C16) ma kinitx prinċipalment miġbura u mqassma fil-membrana ER kollha. Biex inkunu preċiżi, minħabba li l-iggruppament ibbażat fuq iċ-ceramide C26 huwa relatat mill-qrib ma' ERES speċifiċi (Figura 1), imbagħad investigajna jekk dan il-proċess jistax jinvolvi wkoll il-funzjoni tal-mekkaniżmu tal-proteina tal-esportazzjoni ER. GPI-AP juża sistema COPII speċjali għall-esportazzjoni ER, li hija regolata b'mod attiv mir-rimudellar strutturali ta' Ted1 tal-porzjon tal-glikan tal-ankra GPI (30, 31). Il-GPI-glycan rikombinanti mbagħad jiġi rikonoxxut mill-kumpless p24 tar-riċettur tal-merkanzija transmembrana, li min-naħa tiegħu jirrekluta b'mod selettiv Lst1, li hija isoforma speċifika tas-subunità ewlenija li torbot il-merkanzija COPII Sec24, u tifforma COPII rikka fil-GPI-AP. Il-vesikoli COPII huma meħtieġa (31-33). Għalhekk, bnejna mutant doppju li kkombina t-tħassir ta' dawn il-proteini singoli (il-komponent tal-kumpless p24 Emp24, l-enzima ta' rimodellazzjoni tal-GPI-glycan Ted1 u s-subunità speċifika COPII Lst1) mar-razza mutanti sec31-1, u studjajnihom. Huwa possibbli li jiġi ffurmat Gas1-cluster GFP (Figura 3). Osservajna li f'sec31-1emp24Δ u sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP huwa prinċipalment mhux raggruppat u mqassam mal-membrana ER kollha, kif deher qabel f'sec31-1 GhLag1, filwaqt li f'sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Bħal sec31-1. Dawn ir-riżultati jindikaw li minbarra l-preżenza taċ-ċeramide C26 fil-membrana tal-ER, ir-raggruppament ta' Gas1-GFP jeħtieġ ukoll li jingħaqad mal-kumpless p24, u ma jeħtieġx reklutaġġ speċifiku ta' Lst1. Imbagħad, esplorajna l-possibbiltà li t-tul tal-katina taċ-ċeramide fil-membrana tal-ER jista' jirregola r-rabta ta' Gas1-GFP ma' p24. Madankollu, sibna li l-preżenza taċ-ċeramide C18-C16 fil-membrana ma taffettwax il-GPI-glycans rikostruwiti mill-kumpless p24 (Figuri S3 u S4, A u B) jew ir-rabta ma' GPI-AP u l-esportazzjoni ta' GPI-AP. Irrekluta s-sottotip COPII Lst1 (Figura S4C). Għalhekk, ir-raggruppament dipendenti fuq iċ-ċeramide C26 ma jeħtieġx interazzjonijiet ta' proteini ma' mekkaniżmi differenti ta' esportazzjoni ta' proteini tal-ER, iżda jappoġġja mekkaniżmu alternattiv ta' klassifikazzjoni mmexxi mit-tul tal-lipidi. Imbagħad, analizzajna jekk it-tul tal-katina taċ-ċeramide acyl fil-membrana tal-ER huwiex importanti għall-klassifikazzjoni effettiva ta' Gas1-GFP bħala ERES selettiv. Peress li Gas1 fir-razza GhLag1 b'ċeramide b'katina qasira joħroġ mill-ER u jidħol fil-membrana tal-plażma (Figura S5), nemmnu li jekk l-issortjar huwa mmexxi mit-tul tal-katina taċ-ċeramide acyl, il-Gas1 fir-razza GhLag1 jista' jiġi ridirett u inkroċjat. Oġġetti ERES bl-istess membrana.
(A) Il-membrana taċ-ċellula ta' GhLag1 fiha prinċipalment ċeramidi C18-C16 iqsar, filwaqt li l-ankra GPI ta' Gas1-GFP għad għandha l-istess IPC C26 bħaċ-ċelloli tat-tip selvaġġ. Fuq: analiżi tat-tul tal-katina aċilika taċ-ċeramide fil-membrana taċ-ċellula tar-razez tat-tip selvaġġ (Wt) u GhLag1p permezz ta' spettrometrija tal-massa (MS). Id-dejta tirrappreżenta l-perċentwal taċ-ċeramide totali. Il-medja ta' tliet esperimenti indipendenti. Il-linja tal-iżball = SD. Test t mhux imqabbel b'żewġ dnub. **** P <0.0001. Il-pannell tal-qiegħ: Analiżi MS tat-tul tal-katina aċilika tal-IPC preżenti fl-ankra GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) espressa fir-razez tat-tip selvaġġ u GhLag1p. Id-dejta tirrappreżenta l-perċentwal tas-sinjal IPC totali. Medja ta' ħames esperimenti indipendenti. Il-linja tal-iżball = SD. Test t mhux imqabbel b'żewġ dnub. ns, mhux importanti. P = 0.9134. (B) Mikrografi tal-fluworexxenza ta' ċelloli sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ u sec31-1lst1Δ li jesprimu Gas1-GFP indott mill-galattożju ġew inkubati f'temperatura ta' 37°C għal 30 minuta u mgħoddija 'l isfel għal 24°C. Wettaq mikroskopija tal-fluworexxenza ta' rutina wara 24°C. Vleġġa bajda: Raggruppament ta' Gas1-GFP tal-ER. Vleġġa miftuħa: Gas1-GFP mhux raggruppat huwa mqassam fuq il-membrana tal-ER kollha, li juri t-tebgħa taċ-ċirku nukleari karatteristika tal-ER. Bar tal-iskala, 5μm. (Ċ) Kwantifikazzjoni tal-fotomikrografu deskritt f'(B). Il-perċentwal medju ta' ċelloli bi struttura puntwali ta' Gas1-GFP. Fi tliet esperimenti indipendenti, n≥300 ċellula. Bar tal-iżball = SD. Test t mhux imqabbad b'żewġ dnub. **** P <0.0001.
Biex insolvu din il-problema direttament, wettaqna viżwalizzazzjoni SCLIM ta' Gas1-GFP u Mid2-iRFP f'GhLag1 bl-allel mutant sensittiv għat-temperatura sec31-1 (Figura 4 u Film S4). Wara li l-ER inżamm f'temperatura ta' 37°C u sussegwentement ġie rilaxxat f'temperatura ta' 24°C, il-biċċa l-kbira tal-Gas1-GFP sintetizzat ġdid ma kienx miġbur u mqassam mal-membrana tal-ER, kif osservat minn mikroskopji konvenzjonali (Figura 4, A u B). Barra minn hekk, perċentwal kbir ta' ERES (67%) jinkludi żewġ tipi ta' merkanzija ko-lokati fiha (Figura 4D). Il-Panels 1 u 2 tal-Figura 4C juru żewġ eżempji tipiċi ta' ERES b'Gas1-GFP u Mid2-GFP li jikkoinċidu. Barra minn hekk, iż-żewġ oġġetti ġew reklutati fl-istess ERES (Figura 4E, panel 3 u film S4). Għalhekk, ir-riżultati tagħna jindikaw li t-tul tal-katina taċ-ċeramide acyl fil-membrana tal-ER huwa determinanti importanti tal-aggregazzjoni u l-klassifikazzjoni tal-proteini tal-ER.
Ċelloli Sec31-1 GhLag1 li jesprimu sekrezzjonijiet indotti mill-galattożju, Gas1-GFP (GPI-AP, aħdar) u Mid2-iRFP (TMP, blu) u Sec13-mCherry (ERES, maġenta) immarkati b'ERES kostituttivi. Inkuba f'temperatura ta' 37°C. Kompli għal 30 minuta, niżżel għal 24°C biex tirrilaxxa s-sekrezzjonijiet, u ħu immaġni b'SCLIM wara 20 minuta. (A sa C) Immaġni rappreżentattivi ta' projezzjoni 2D (A; skala bar, 1μm) jew immaġni 3D tal-emisfera taċ-ċelluli (B u C; unità tal-iskala, 0.45μm) tal-10 sezzjonijiet z immarkati bil-merkanzija u l-ERES. Il-pannell t'isfel f'(B) u l-pannell f'(C) juru immaġni pproċessati biex juru biss l-oġġetti preżenti fl-ERES (maġenta) [Gas1-GFP (griż) u Mid2-iRFP (blu ċar)]. (C) Vleġġa mimlija bajda: ERES, oġġetti jikkoinċidu. Vleġġa miftuħa: L-ERES fih oġġett wieħed biss. Il-pannell t'isfel: L-ERES magħżul għandu oġġetti li jikkoinċidu (1 u 2) immarkati f'(C). Bar tal-iskala, 100 nm. (D) Kwantifikazzjoni tal-fotomikrografu deskritt f'(C). Fl-unitajiet sec31-1 u sec31-1 GhLag1, merkanzija waħda biss (Gas1-GFP jew Mid2-iRFP) hija inkluża, u l-perċentwal medju tal-ERES għal merkanzija iżolata u merkanzija li tikkoinċidi. Fi tliet esperimenti indipendenti, n = 432 f'54 ċellula (sec31-1) u n = 430 f'47 ċellula (sec31-1 GhLag1). Bar tal-iżball = SD. Test t mhux imqabbel b'żewġ dnub. *** P = 0.0002 (sec31-1) u ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Immaġni 3D tal-ERES magħżul b'merkanzija li tikkoinċidi (3) immarkata f'(C). Gas1-GFP (aħdar) u Mid2-iRFP (blu) jersqu lejn l-ERES (magenta) mill-istess naħa u jibqgħu fl-istess żona ristretta tal-ERES. Skala tal-iskala, 100 nm.
Dan l-istudju jipprovdi evidenza diretta in vivo li tagħbijiet ta' proteini bbażati fuq il-lipidi huma kklassifikati f'siti ta' esportazzjoni selettivi fil-mogħdija sekretorja, u jiżvela l-importanza tat-tul tal-katina aċilika għas-selettività tal-klassifikazzjoni. Bl-użu ta' teknika ta' mikroskopija qawwija u avvanzata msejħa SCLIM, wrejna l-Gas1-GFP sintetizzat ġdid (GPI-AP ewlieni tal-membrana tal-plażma b'porzjon lipidiku taċ-ċeramide b'katina aċilika twila ħafna (C26)) fil-ħmira). Ir-reġjuni miġbura f'ERs diskreti huma assoċjati ma' ERES speċifiċi, filwaqt li l-proteini sekretati transmembrana huma mqassma mal-membrana tal-ER (Figura 1). Barra minn hekk, dawn iż-żewġ tipi ta' oġġetti jidħlu f'ERES differenti b'mod selettiv (Figura 2). It-tul tal-katina aċilika taċ-ċeramide ċellulari fil-membrana jitnaqqas minn C26 għal C18-C16, il-grupp Gas1-GFP jiġi mfixkel fir-reġjun diskret tal-ER, u l-Gas1-GFP jiġi dirottat biex jitlaq mill-ER bil-proteina transmembrana permezz tal-istess ERES (Figura 3 u Figura 3).4).
Għalkemm il-GPI-AP juża mekkaniżmu speċjalizzat ta' proteini biex joħroġ mill-ER, sibna li s-separazzjoni dipendenti miċ-ċeramide C26 ma tiddependix fuq interazzjonijiet differenzjali ta' proteini li jistgħu jwasslu għal speċjalizzazzjoni fl-ERES (Figuri S4 u S5). Minflok, is-sejbiet tagħna jappoġġjaw mekkaniżmu ta' klassifikazzjoni alternattiv immexxi minn raggruppament ta' proteini bbażat fuq il-lipidi u esklużjoni sussegwenti ta' tagħbijiet oħra. L-osservazzjonijiet tagħna jindikaw li r-reġjun jew raggruppament Gas1-GFP assoċjat ma' ERES speċifiku m'għandux il-proteina sekretata transmembrana Mid2-iRFP, li jindika li r-raggruppament GPI-AP dipendenti miċ-ċeramide C26 se jiffaċilita d-dħul tagħhom fl-ERES rilevanti, u fl-istess ħin, jeskludi s-sekrezzjonijiet transmembrana jidħlu f'dan l-ERES partikolari (Figuri 1 u 2). B'kuntrast, il-preżenza ta' ċeramidi C18-C16 fil-membrana tal-ER ma tikkawżax li l-GPI-AP jifforma reġjuni jew raggruppamenti, għalhekk ma jeskludux jew jissostitwixxu proteini sekretati transmembrana fl-istess ERES (Figuri 3 u 4). Għalhekk, nipproponu li ċ-ċeramide C26 issuq is-separazzjoni u l-klassifikazzjoni billi tiffaċilita l-aggruppament ta' proteini marbuta ma' ERES speċifiċi.
Kif jinkiseb dan l-irraggruppament dipendenti fuq iċ-ċeramide C26 f'żona ER speċifika? It-tendenza taċ-ċeramide tal-membrana li tissepara lateralment tista' tikkawża li l-GPI-AP u ċ-ċeramide C26 jiffurmaw lipidi żgħar u ordnati istantanjament fl-ambjent lipidiku aktar irregolari tal-membrana ER li fih gliċerolipidi iqsar u mhux saturati. Raggruppamenti ta' kwalità (17, 18). Dawn ir-raggruppamenti temporanji żgħar jistgħu jiġu mdewba aktar fi raggruppamenti akbar u aktar stabbli wara li jorbtu mal-kumpless p24 (34). Konsistenti ma' dan, wrejna li C26 Gas1-GFP jeħtieġ li jinteraġixxi mal-kumpless p24 biex jifforma raggruppamenti viżibbli akbar (Figura 3). Il-kumpless p24 huwa oligomeru eterożigut magħmul minn erba' proteini transmembrana p24 differenti fil-ħmira (35), li jipprovdi rbit multivalenti, li jista' jwassal għal cross-linking ta' raggruppamenti żgħar ta' GPI-AP, u b'hekk jiġġenera raggruppament Stabbli akbar (34). L-interazzjoni bejn l-ektodominji tal-proteini tal-GPI-APs tista' wkoll tikkontribwixxi għall-aggregazzjoni tagħhom, kif muri waqt it-trasport Golgi tagħhom fiċ-ċelloli epiteljali polarizzati tal-mammiferi (36). Madankollu, meta ċ-ċeramide C18-C16 tkun preżenti fil-membrana ER, meta l-kumpless p24 jingħaqad ma' Gas1-GFP, ma jiġux iffurmati gruppi kbar separati. Il-mekkaniżmu sottostanti jista' jiddependi fuq il-proprjetajiet fiżiċi u kimiċi speċifiċi taċ-ċeramide b'katina aċilika twila. Studji bijofiżiċi ta' membrani artifiċjali juru li għalkemm kemm iċ-ċeramidi b'katina aċilika twila (C24) kif ukoll dawk qosra (C18-C16) jistgħu jikkawżaw separazzjoni tal-fażijiet, iċ-ċeramidi b'katina aċilika twila (C24) biss jistgħu jippromwovu Kurvatura għolja u liwi tal-film biex iffurmaw mill-ġdid il-film. Permezz ta' referenza reċiproka (17, 37, 38). Intwera li l-elika transmembrana ta' TMED2, l-omologu uman ta' Emp24, tinteraġixxi b'mod selettiv ma' sfingomjelina bbażata fuq iċ-ċeramide C18 fil-lobuli ċitoplasmiċi (39). Bl-użu ta' simulazzjonijiet tad-dinamika molekulari (MD), sibna li kemm iċ-ċeramidi C18 kif ukoll C26 jakkumulaw madwar il-lobuli ċitoplasmiċi tal-elika transmembrana ta' Emp24, u għandhom preferenzi simili (Figura S6). Ta' min jinnota li dan jindika li l-elika transmembrana ta' Emp24 tista' twassal għal distribuzzjoni asimmetrika tal-lipidi fil-membrana. Dan huwa riżultat reċenti bbażat fuq ċelloli tal-mammiferi. Simulazzjonijiet MD simili juru wkoll il-preżenza ta' lipidi tal-etere (40). Għalhekk, nispekulaw li ċ-ċeramide C26 fiż-żewġ lobuli ta' ER26 hija arrikkita lokalment. Meta l-GPI-AP fil-lobuli luminali jingħaqad direttament ma' p24 multivalenti u l-akkumulazzjoni ta' ċeramide C26 madwar p24 fil-lobuli ċitoplasmiċi, dan jista' jippromwovi l-aggregazzjoni tal-proteini li takkumpanjaha u l-kurvatura tal-membrana li jiġu ġġenerati permezz tas-swaba' (41), u b'hekk il-GPI-AP jissepara f'reġjuni diskreti biswit l-ERES, li jiffavorixxi wkoll ir-reġjuni mgħawġa ħafna tal-membrana tal-ER (42). Rapporti preċedenti appoġġjaw il-mekkaniżmu propost (43, 44). L-irbit multivalenti ta' oligolectins, patoġeni jew antikorpi ma' glikosfingolipidi bbażati fuq iċ-ċeramide (GSL) fuq il-membrana tal-plażma jqanqal aggregazzjoni kbira ta' GSL, itejjeb is-separazzjoni tal-fażijiet u jikkawża deformazzjoni u internalizzazzjoni tal-membrana (44). Iwabuchi eċċ. (43) Instab li fil-preżenza ta' ktajjen aċiliċi twal (C24) iżda mhux qosra (C16), il-ligand multivalenti marbut mal-lattosilċeramide GSL ikkaġuna l-formazzjoni ta' gruppi kbar u invaġinazzjoni tal-membrana, u t-trażduzzjoni tas-sinjal medjata minn Lyn taċ-ċitoplasma fuq il-fuljetti hija interdiġitata minn ktajjen aċiliċi f'newtrofili akkoppjati.
Fiċ-ċelloli epiteljali polarizzati tal-mammiferi, il-konċentrazzjoni tan-netwerk anti-Golgi (TGN) sal-livell tal-membrana apikali tal-plażma tikkontrolla s-separazzjoni u l-issortjar tal-GPI-AP (10, 45). Din l-aggregazzjoni hija mmexxija mill-oligomerizzazzjoni tal-GPI-AP (36), iżda tista' tiddependi wkoll mit-tul tal-katina taċ-ċeramide li nsibu fil-ħmira. Għalkemm il-GPI-AP tal-mammiferi għandu ankra bbażata fuq il-lipidi tal-etere, u l-istruttura kimika tiegħu hija differenti ħafna miċ-ċeramide b'katina aċilika twila ħafna, studju reċenti sab li ż-żewġ lipidi għandhom proprjetajiet fiżiċi u kimiċi u funzjoni evoluzzjonalment simili (40). Għalhekk, il-parti tal-lipidi tal-etere fiċ-ċelloli tal-mammiferi tista' tkun simili għaċ-ċeramide C26 fil-ħmira, u r-rwol tagħha huwa li tassoċja maċ-ċeramide b'katina twila fil-membrana biex tippromwovi l-aggregazzjoni u l-issortjar tal-GPI-AP. Għalkemm din il-possibbiltà għad trid tiġi ttestjata direttament, sejbiet preċedenti jappoġġjaw li t-trasport taċ-ċeramide b'katina aċilika twila lejn il-ġisem ta' Golgi ma jitwettaqx minn proteini ta' trasferiment ċitoplasmiċi, iżda jiddependi mis-sintesi ta' ankri tal-GPI bħall-ħmira. Għalhekk, il-mekkaniżmu konservattiv evoluzzjonarju jidher li kapaċi jittrasporta b'mod selettiv ċeramide b'katina aċilika twila ħafna u GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) fl-istess vesikula tat-trasport.
Fis-sistemi taċ-ċelluli epiteljali polarizzati tal-ħmira u tal-mammiferi, l-aggregazzjoni u s-separazzjoni tal-GPI-AP minn proteini oħra tal-membrana tal-plażma kollha jseħħu qabel ma jilħqu l-wiċċ taċ-ċellula. Paladino et al. (48) sabu li fuq it-TGN taċ-ċelluli epiteljali polarizzati tal-mammiferi, l-aggregazzjoni tal-GPI-AP mhux biss hija meħtieġa għall-klassifikazzjoni selettiva tal-GPI-APs għall-membrana tal-plażma apikali, iżda tirregola wkoll l-organizzazzjoni tal-aggregazzjoni tal-GPI-APs u l-attività bijoloġika tagħha. Wiċċ taċ-ċellula. Fil-ħmira, dan l-istudju wera li l-grupp ta' GPI-AP dipendenti fuq iċ-ċeramide C26 fuq l-ER jista' jirregola l-organizzazzjoni tal-aggregazzjoni u l-attività funzjonali tal-GPI-AP fuq il-membrana tal-plażma (24, 49). Konsistenti ma' dan il-mudell, iċ-ċelluli GhLag1 huma allerġiċi għall-inibituri tal-GPI jew drogi li jaffettwaw l-integrità tal-ħajt taċ-ċellula (28), u l-ħtieġa għal gruppi funzjonali ta' Gas1-GFP (49) taċ-ċeramide tal-ponta pproġettata fit-tgħammir taċ-ċelluli tal-ħmira tindika G Konsegwenzi fiżjoloġiċi possibbli taċ-ċelluli hLag1. Żball fil-GPI-AP. Madankollu, aktar ittestjar dwar jekk l-organizzazzjoni funzjonali tal-wiċċ taċ-ċellula ġietx ipprogrammata mill-ER permezz ta' metodu ta' klassifikazzjoni bbażat fuq it-tul tal-lipidi se jkun is-suġġett tar-riċerka futura tagħna.
Ir-razez ta' Saccharomyces cerevisiae użati f'dan ix-xogħol huma elenkati fit-Tabella S1. Ir-razez MMY1583 u MMY1635 ta' SCLIM għall-immaġini ta' ċelluli ħajjin inbnew fl-isfond ta' W303. Dawn ir-razez li jesprimu Sec13-mCherry b'tikketta ta' proteina fluworexxenti nbnew bl-użu ta' metodu bbażat fuq reazzjoni katina tal-polimerażi (PCR) bil-plasmid pFA6a bħala mudell (23). Ir-razza li tesprimi Mid2-iRFP immarkata bi proteina fluworexxenti taħt il-kontroll tal-promotur GAL1 inbniet kif ġej. Amplifikazzjoni PCR tas-sekwenza iRFP-KanMx mill-vettur pKTiRFP-KAN (rigal ta' E. O'Shea, plażmid Addgene numru 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identifikatur tar-riżorsi tar-riċerka (RRID): Addgene_64687) U mdaħħla fit-tarf C ta' Mid2 endoġenu. Wara li s-sekwenza tal-ġenoma Mid2-iRFP ġiet amplifikata u kklonata fil-promotur GAL1, din ġiet integrata fis-sit Not I-Sac I tal-plasmid ta' integrazzjoni pRS306. Il-plasmid pRGS7 li rriżulta ġie linearizzat ma' Pst I biex jintegra fil-locus URA3.
Il-ġene tal-fużjoni Gas1-GFP huwa espress taħt il-kontroll tal-promotur GAL1 fil-plasmid taċ-ċentromeru (CEN), li huwa mibni kif ġej. Is-sekwenza Gas1-GFP ġiet amplifikata permezz ta' PCR mill-plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (rigal ta' L. Popolo) u kklonata fis-sit Xma I–Xho I tal-plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (rigal ta' C). Miller; Plasmid Addgene numru 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Il-plasmid li rriżulta ssemma pRGS6. Il-ġene tal-fużjoni Axl2-GFP huwa espress ukoll taħt il-kontroll tal-promotur GAL1 tal-vettur pBEVY-GL LEU2, u l-kostruzzjoni tiegħu hija kif ġej. Is-sekwenza Axl2-GFP ġiet amplifikata mill-plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) permezz ta' PCR, u ġiet ikklonata fis-sit Bam HI-Pst I tal-vettur pBEVY-GL LEU2. Il-plasmid li rriżulta ssemma pRGS12. Is-sekwenza tal-oligonukleotidi użati f'dan l-istudju hija elenkata fit-Tabella S2.
Ir-razza ġiet supplimentata b'0.2% adenina u 2% glukożju [YP-destrożju (YPD)], 2% raffinożju [YP-raffinożju] estratt tal-ħmira rikk fil-proteina p (YP) f'mezz (1% estratt tal-ħmira u 2% proteina ept). (YPR)] jew 2% galattożju [YP-galattożju (YPG)] bħala sors ta' karbonju, jew f'mezz sintetiku minimu (0.15% bażi tan-nitroġenu tal-ħmira u 0.5% sulfat tal-ammonju) biex tissupplimenta l-aċidi amminiċi u l-bażijiet xierqa meħtieġa għan-nutrizzjoni, u li fih 2% glukożju (mezz sintetiku minimu tal-glukożju) jew 2% galattożju (mezz sintetiku minimu tal-galattożju) bħala sors ta' karbonju.
Għal immaġini f'ħin reali, ċelloli mutanti sec31-1 sensittivi għat-temperatura li jesprimu l-kostruzzjoni taħt il-promotur GAL1 ġew imkabbra f'mezz YPR f'24°C matul il-lejl sal-fażi ta' nofs il-logaritmu. Wara l-induzzjoni f'YPG f'24°C għal siegħa, iċ-ċelloli ġew inkubati f'SG f'37°C għal 30 minuta, u mbagħad trasferiti għal 24°C biex jinħelsu mill-blokk tas-sekrezzjoni. Concanavalin A intuża biex jiffissa ċ-ċelloli fuq slide tal-ħġieġ u ġew immaġinati permezz ta' SCLIM. SCLIM hija taħlita ta' mikroskopju fluworexxenti invertit Olympus IX-71 u lenti taż-żejt b'apertura numerika UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), skaner konfokali b'diska li ddur b'veloċità għolja u proporzjon sinjal-ħoss għoli (Yokogawa Electric), spettrometru apposta, u tkessiħ apposta. L-intensifikatur tal-immaġni tas-sistema (Hamamatsu Photonics) jista' jipprovdi sistema ta' lentijiet li jkabbru b'ingrandiment finali ta' ×266.7 u kamera b'apparat charge-coupled li timmultiplika l-elettroni (Hamamatsu Photonics) (21). L-akkwist tal-immaġni jitwettaq permezz ta' softwer apposta (Yokogawa Electric). Għal immaġnijiet 3D, użajna attwatur pjeżoelettriku magħmul apposta biex nivvibraw il-lenti oġġettiva vertikalment, u ġbarna l-partijiet ottiċi 100 nm 'il bogħod minn xulxin f'munzell. L-immaġni Z-stack hija kkonvertita f'dejta voxel 3D, u l-funzjoni teoretika tat-tixrid tal-punt użata għall-mikroskopju konfokali b'diska li ddur tintuża għall-ipproċessar tad-dekonvoluzzjoni permezz tas-softwer Volocity (PerkinElmer). Bl-użu tas-softwer Volocity biex awtomatikament jiġi stabbilit il-limitu għall-analiżi tal-ko-lokazzjoni, tkejlu l-ERES inkluża l-merkanzija. L-analiżi tal-iskannjar tal-linja twettqet bl-użu tas-softwer MetaMorph (Molecular Devices).
Uża s-softwer GraphPad Prism biex tiddetermina s-sinifikat statistiku. Għat-test-t ta' Student b'żewġt itruf u t-test ordinarju tal-analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda (ANOVA), id-differenzi bejn il-gruppi huma kkunsidrati li għandhom impatt sinifikanti fuq P <0.05 (*).
Għall-mikroskopija tal-fluworexxenza ta' Gas1-GFP, iċ-ċelloli tal-fażi logaritmika tkabbru matul il-lejl f'YPD u nġabru permezz ta' ċentrifugazzjoni, inħaslu darbtejn b'salina b'buffer tal-fosfat, u ġew inkubati fuq is-silġ għal mill-inqas 15-il minuta, u mbagħad ipproċedew taħt il-mikroskopju kif deskritt qabel Check (24). Il-mikroskopju Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) mgħammar b'lenti oġġettiva, filtru L5 (GFP), kamera Hamamatsu u s-softwer Application Suite X (LAS X) intuża għall-akkwist.
Il-kampjuni ġew denaturati b'buffer tal-kampjun SDS f'65°C għal 10 minuti, u mbagħad separati permezz ta' elettroforesi bil-ġel SDS-polyacrylamide (PAGE). Għall-analiżi tal-immunoblotting, 10 μl tal-kampjun ġew mgħobbija għal kull korsija. Antikorp primarju: Uża anti-Gas1 poliklonali tal-fenek f'dilwizzjoni ta' 1:3000, anti-Emp24 poliklonali tal-fenek f'dilwizzjoni ta' 1:500, u anti-GFP poliklonali tal-fenek (rigal mingħand H. Riezman) f'dilwizzjoni ta' 1:3000. L-antikorp monoklonali tal-ġrieden anti-Pgk1 intuża f'dilwizzjoni ta' 1:5000 (rigal mingħand J. de la Cruz). Antikorp sekondarju: Immunoglobulina G (IgG) tal-mogħoż kontra l-fenek konjugata ma' Horseradish peroxidase (HRP) użata f'dilwizzjoni ta' 1:3000 (Pierce). IgG tal-mogħoż kontra l-ġrieden konjugata ma' HRP intużat f'dilwizzjoni ta' 1:3000 (Pierce). Iż-żona tar-rispons immuni ġiet osservata bil-metodu ta' kemiluminexxenza tar-reaġent SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Kif deskritt f'(31), twettaq esperiment ta' immunopreċipitazzjoni naturali fuq il-frazzjoni ER arrikkita. Fil-qosor, aħsel iċ-ċelloli tal-ħmira b'buffer TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride u taħlita ta' inibitur tal-protease) f'600 nm (OD600) b'densità ottika ta' 100 darbtejn. Dan inkiser b'żibeġ tal-ħġieġ, u mbagħad il-fdalijiet taċ-ċelloli u ż-żibeġ tal-ħġieġ tneħħew permezz ta' ċentrifugazzjoni. Is-supernatant imbagħad ġie ċċentrifugat f'17,000 g għal 15-il minuta f'4°C. Il-gerbub ġie sospiż mill-ġdid f'TNE u s-saponin diġitali ġie miżjud għal konċentrazzjoni finali ta' 1%. Is-sospensjoni ġiet inkubata għal siegħa b'rotazzjoni f'4°C, u mbagħad il-komponenti insolubbli tneħħew permezz ta' ċentrifugazzjoni f'13,000 g f'4°C għal 60 minuta. Għal immunopreċipitazzjoni Gas1-GFP, l-ewwel inkuba minn qabel il-kampjun b'żibeġ tal-agarose vojta (ChromoTek) f'4°C għal siegħa, u mbagħad inkuba b'GFP-Trap_A (ChromoTek) f'4°C għal 3 sigħat. Iż-żibeġ immunopreċipitati nħaslu ħames darbiet b'TNE li kien fih 0.2% digoxigenin, ġew elużi b'buffer tal-kampjun SDS, separati fuq SDS-PAGE, u analizzati permezz ta' immunoblotting.
Kif deskritt f'(31), id-determinazzjoni tal-cross-linking twettqet fuq il-frazzjoni ER arrikkita. Fil-qosor, il-frazzjoni ER arrikkita ġiet inkubata b'0.5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). Ir-reazzjoni tal-cross-linking ġiet imkessħa billi żdiedet il-gliċina (konċentrazzjoni finali ta' 50 mM, 5 minuti, 20°C).
Kif deskritt qabel (50), twettqet analiżi MS taċ-ċeramide f'razez tat-tip selvaġġ u GhLag1. Fil-qosor, iċ-ċelloli tkabbru sal-fażi esponenzjali (3 sa 4 unitajiet OD600/ml) f'YPD fi 30°C, u nġabru 25×107 ċelloli. Il-metaboliżmu tagħhom jitwaqqaf bl-aċidu trikloroaċetiku. Uża solvent ta' estrazzjoni [etanol, ilma, etere, piridina u 4.2 N idrossidu tal-ammonju (15:15:5:1:0.018 v/v)] u 1.2 nmol ta' ċeramide standard intern C17 (860517, Avanti polar lipid) ta' kwalità). Uża reaġent tal-monometilamina [metanol, ilma, n-butanol u soluzzjoni tal-metilamina (4:3:1:5 v/v)] biex twettaq idroliżi alkalina ħafifa tal-estratt, u mbagħad uża n-butanol saturat bl-ilma biex tneħħi l-melħ. Fl-aħħar, l-estratt ġie sospiż mill-ġdid f'solvent f'modalità pożittiva [kloroform/metanol/ilma (2:7:1) + 5 mM aċetat tal-ammonju] u injettat fl-ispettrometru tal-massa. Sar monitoraġġ ta' reazzjoni multipla (MRM) għall-identifikazzjoni u l-kwantifikazzjoni tal-molekuli sfingolipidi. L-ispettrometru tal-massa kwadrupol terzjarju TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) huwa mgħammar b'sors ta' joni nanoflow robotiku Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) għall-analiżi tal-lipidi. L-enerġija tal-ħabta hija ottimizzata għal kull kategorija ta' ċeramide. Id-dejta MS inkisbet f'modalità pożittiva. Għal kull replika bijoloġika, is-sinjal tal-lipidi huwa l-medjan ta' tliet kejl indipendenti.
Kif deskritt f'(31), iċ-ċelloli (800×107) li jesprimu Gas1-GFP ġew soġġetti għal immunopreċipitazzjoni naturali. Il-Gas1-GFP purifikat ġie separat permezz ta' SDS-PAGE u trasferit għal membrana tal-poliviniliden fluworidu (PVDF). Il-proteina ġiet viżwalizzata billi l-PVDF ġie mtebba' bl-iswed tal-amide. Il-faxxa Gas1-GFP inqatgħet mill-PVDF u nħaslet 5 darbiet bil-metanol u darba b'ilma ta' grad kromatografija likwida-MS (LC-MS). Billi tinkuba l-istrixxa tal-membrana b'500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), buffer u 500μl taħlita ta' 1 M sodium nitrite maħlula friska f'37°C għal 3 sigħat, il-frazzjoni tal-lipidi tiġi rilaxxata minn Gas1-GFP u liżata bejn il-glukosamina u l-inositol (51). Wara dan, l-istrixxa tal-membrana nħaslet erba' darbiet b'ilma ta' grad LC-MS, tnixxfet f'temperatura tal-kamra, u nħażnet f'atmosfera ta' nitroġenu f'-80°C sakemm saret l-analiżi. Bħala kontroll, intuża kampjun vojt ta' membrana PVDF għal kull esperiment. Il-lipidi estratti minn Gas1-GFP imbagħad ġew analizzati permezz ta' MS kif deskritt (50). Fil-qosor, l-istrixxi PVDF li fihom lipidi GPI ġew sospiżi mill-ġdid f'75μl solvent negattiv tal-moffa [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM aċetat tal-ammonju] u għaddew minn jonizzazzjoni bl-elettrosprej (ESI)-MRM/MS Analysis tal-ispeċi sfingolipidi (TSQ Vantage). F'dan il-każ, id-dejta MS inkisbet fil-modalità ta' joni negattivi.
Kif imsemmi qabel, il-porzjon lipidiku tal-ankra GPI ġie separat mill-GPI-AP immarkat b'[3H]-inositol (16). Il-lipidi ġew separati permezz ta' kromatografija fuq saff irqiq bl-użu ta' sistema ta' solvent (55:45:10 kloroform-metanol-0.25% KCl) u viżwalizzati bl-użu ta' FLA-7000 (Fujifilm).
Iċ-ċelloli li jesprimu Gas1-GFP (600×107) inħaslu darbtejn b'buffer TNE, u tkissru b'żibeġ tal-ħġieġ, u mbagħad ġew ċentrifugati biex jitneħħew il-fdalijiet taċ-ċelloli u ż-żibeġ tal-ħġieġ. Is-supernatant imbagħad ġie ċentrifugat f'17,000 g għal siegħa f'4°C. Il-gerbub inħasel f'TNE u ġie inkubat b'1 U PI-PLC (Invitrogen) f'TNE li kien fih 0.2% digitalis saponin għal siegħa f'37°C. Wara t-trattament bl-enżimi, il-membrana tneħħiet permezz ta' ċentrifugazzjoni f'17,000 g f'4°C għal siegħa. Biex jiġi immunopreċipitat Gas1-GFP, is-supernatant ġie inkubat b'GFP-Trap_A (ChromoTek) f'4°C matul il-lejl. Il-Gas1-GFP purifikat separat permezz ta' SDS-PAGE ġie mtebba' b'Coomassie brilliant blue. Il-faxxa tat-tebgħa Gas1-GFP inqatgħet mill-griż li jdawwar l-akwedott, u mbagħad wara alkilazzjoni b'jodoacetamide u tnaqqis b'dithiothreitol, twettqet diġestjoni fil-ġel bit-trypsin. Estrai u nixxef il-peptidi triptiċi u l-peptidi b'GPI-glycans. Il-peptid imnixxef ġie maħlul f'20 μl ta' ilma. Injetta porzjon (8μl) fl-LC. Kolonna octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; dijametru intern 150 mm × 1.0 mm; Nomura Chemical, Prefettura ta' Aichi, Ġappun) intużat biex tissepara l-peptidi taħt kundizzjonijiet speċifiċi ta' gradjent. Il-fażi mobbli hija s-solvent A (0.08% aċidu formiku) u s-solvent B (0.15% aċidu formiku fi 80% aċetonitrile). Sistema Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) intużat biex tiġi elużata l-kolonna bis-solvent A fi żmien 55 minuta b'rata ta' fluss ta' 50 μl min-1 għal 5 minuti, u mbagħad il-konċentrazzjoni tas-solvent B żdiedet għal 40%. , Stati Uniti). L-eluat ġie introdott kontinwament fis-sors tal-jone ESI, u l-peptidi triptiċi u l-peptidi bil-GPI-glycans ġew analizzati permezz ta' LTQ Orbitrap XL (spettrometru tal-massa ibridu lineari ta' nassa tal-jone-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). Fis-setup tal-MS, il-vultaġġ tas-sors kapillari ġie ssettjat għal 4.5 kV, u t-temperatura tal-kapillari tat-trasferiment inżammet fi 300°C. Il-vultaġġ kapillari u l-vultaġġ tal-lenti tat-tubu ġew issettjati għal 15 V u 50 V, rispettivament. Id-dejta MS inkisbet fil-modalità tal-jone pożittiv (riżoluzzjoni ta' 60,000; preċiżjoni tal-massa ta' 10 partijiet kull miljun) f'medda ta' massa ta' 300/m/z proporzjon tal-massa/ċarġ (m/z) 3000. Id-dejta MS/MS tinkiseb permezz tan-nassa tal-jone fl-LTQ Orbitrap XL [l-ewwel 3 ċifri li fuqhom tiddependi d-dejta, dissoċjazzjoni indotta minn ħabta (CID)].
Is-simulazzjonijiet tal-MD twettqu bl-użu tas-softwer GROMACS (52) u l-kamp tal-forza MARTINI 2 (53-55). Il-CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) imbagħad intuża biex jinbena saff doppju li fih dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) u Cer C18 jew DOPC u Cer C26. It-topoloġija u l-koordinati ta' Cer C26 huma derivati ​​minn DXCE billi jitneħħew iż-żibeġ żejda mid-denb tal-isfingosina. Uża l-proċess deskritt hawn taħt biex tibbilanċja s-saff doppju u mexxih, imbagħad uża l-aħħar koordinati tas-sistema biex tibni sistema li fiha Emp24. Id-dominju transmembrana tal-ħmira Emp24 (residwi 173 sa 193) inbena bħala α-helix bl-użu tal-istruttura molekulari tal-għodda viżwali MD (VMD) (58). Imbagħad, wara li tneħħew il-lipidi li jikkoinċidu, il-proteina ġiet granulata b'mod oħxon u mdaħħla fis-saff doppju bl-użu tal-CHARMM GUI. Is-sistema finali fiha 1202 DOPC u 302 Cer C26 jew 1197 DOPC u 295 Cer C18 u Emp24. Jonizza s-sistema għal konċentrazzjoni ta' 0.150M. Saru erba' repliki indipendenti għal żewġ kompożizzjonijiet ta' saff doppju.
Is-saff doppju tal-lipidi huwa bbilanċjat bl-użu tal-proċess CHARMM GUI, li jinvolvi l-minimizzazzjoni u mbagħad il-bilanċjar ta' 405,000 pass, fejn ir-restrizzjonijiet tal-pożizzjoni jitnaqqsu u jiġu eliminati gradwalment, u l-pass tal-ħin jiżdied minn 0.005 ps għal 0.02 ps. Wara l-ekwilibrazzjoni, jipproduċi 6 µs b'pass tal-ħin ta' 0.02 ps. Wara li tiddaħħal Emp24, uża l-istess proċess CHARMM GUI biex timminimizza u tibbilanċja s-sistema, u mbagħad ħaddem għal 8 sekondi fil-produzzjoni.
Għas-sistemi kollha, matul il-proċess ta' bbilanċjar, il-pressjoni hija kkontrollata mill-barostat Berendsen (59), u matul il-proċess ta' produzzjoni, il-pressjoni hija kkontrollata mill-barostat Parrinello-Rahman (60). Fil-każijiet kollha, il-pressjoni medja hija ta' 1 bar u tintuża skema ta' akkoppjar ta' pressjoni semi-iżotropika. Fil-proċess ta' bbilanċjar u produzzjoni, jintuża termostat (61) b'kalibrazzjoni mill-ġdid tal-veloċità biex jakkoppja t-temperatura tal-proteini, il-lipidi u l-partiċelli tas-solvent rispettivament. Matul l-operazzjoni kollha, it-temperatura fil-mira hija ta' 310K. L-interazzjoni mhux ta' rbit hija kkalkulata billi tiġi ġġenerata lista ta' tqabbil bl-użu tal-iskema Verlet b'tolleranza ta' buffer ta' 0.005. It-terminu Coulomb huwa kkalkulat bl-użu tal-kamp ta' reazzjoni u distanza ta' qtugħ ta' 1.1 nm. It-terminu Vander Waals juża skema ta' qtugħ b'distanza ta' qtugħ ta' 1.1 nm, u l-iskema ta' qtugħ Verlet tintuża għad-drift potenzjali (62).
Bl-użu tal-VMD, il-wavelength tal-qtugħ bejn iż-żibeġ tal-fosfat DOPC jew iż-żibeġ taċ-ċeramide AM1 u l-proteina huwa ta' 0.7 nm, u n-numru ta' lipidi li jinteraġixxu mal-proteina huwa kkalkulat. Skont il-formula li ġejja, ikkalkula l-fattur ta' arrikkiment ta' tnaqqis (DE) bħal f'(63): Fattur DE = (l-ammont ta' lipidi totali fil-proteina 0.7) fil-proteina 0.7 (l-ammont ta' Cer fil-lipidi totali)
Il-valur irrappurtat jinkiseb bħala medja, u l-vireg tal-iżball huma erba' kopji indipendenti ta' SE. Is-sinifikat statistiku tal-fattur DE huwa kkalkulat bit-test t [(medja tal-fattur DE-1)/SE]. Ikkalkula l-valur P mid-distribuzzjoni b'denb wieħed.
L-għodda GROMACS intużat biex tikkalkula l-mappa tad-densità laterali 2D tas-sistema li fiha Emp24 fl-aħħar 250 ns tat-traċċa. Sabiex tinkiseb il-mappa tal-arrikkiment/tnaqqis taċ-ċeramide, il-mappa tad-densità ta' Cer hija diviża bis-somma tal-mappa ta' Cer u DOPC, u mbagħad diviża bil-konċentrazzjoni ta' Cer fil-ġisem. Tintuża l-istess skala tal-mappa tal-kulur.
Għal materjali supplimentari għal dan l-artiklu, jekk jogħġbok ara http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Dan huwa artiklu b'aċċess miftuħ imqassam skont it-termini tal-Liċenzja Creative Commons Attribution-Non-Commercial, li tippermetti l-użu, id-distribuzzjoni u r-riproduzzjoni fi kwalunkwe mezz, sakemm l-użu finali ma jkunx għal qligħ kummerċjali u l-premessa hija li x-xogħol oriġinali huwa korrett. Referenza.
Nota: Nitolbuk biss li tipprovdi l-indirizz elettroniku tiegħek sabiex il-persuna li tirrakkomanda lill-paġna tkun taf li tridha tara l-email u li mhijiex spam. Mhux se naqbdu l-ebda indirizz elettroniku.
Din il-mistoqsija tintuża biex tittestja jekk intix viżitatur u tipprevjeni s-sottomissjoni awtomatika ta' spam.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Arko Ho Miho (Sergio Lopez), Arko Miho Waga (Misko Lopez), Arko Miho Waga Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
L-immaġini 3D f'ħin reali b'riżoluzzjoni għolja tiżvela l-importanza tat-tul tal-katina taċ-ċeramide għall-issortjar tal-proteini f'siti ta' output selettivi.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Arko Ho Miho (Sergio Lopez), Arko Miho Waga (Misko Lopez), Arko Miho Waga Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
L-immaġini 3D f'ħin reali b'riżoluzzjoni għolja tiżvela l-importanza tat-tul tal-katina taċ-ċeramide għall-issortjar tal-proteini f'siti ta' output selettivi.
©2020 Assoċjazzjoni Amerikana għall-Avvanz tax-Xjenza. id-drittijiet kollha riżervati. AAAS hija sieħba ta' HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef u COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.