Grazzi talli żort Nature.com. Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għas-CSS. Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew titfi l-modalità ta' kompatibilità fl-Internet Explorer). Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, se nuru s-sit mingħajr stili u JavaScript.
B'differenza mill-vertebrati, l-insetti huma maħsuba b'mod wiesa' li m'għandhomx ormoni sterojdi sesswali preġudikati lejn l-irġiel. F'Anopheles gambiae, l-isterojde ecdysone 20-hydroxyecdysone (20E) jidher li evolva biex jikkontrolla l-iżvilupp tal-bajd meta jiġi sintetizzat min-nisa2 u biex jikkaġuna perjodu refrattorju ta' tgħammir meta jiġi trasferit sesswalment mill-irġiel3. Peress li l-iżvilupp u t-tgħammir tal-bajd huma karatteristiċi riproduttivi essenzjali, il-fehim ta' kif in-nemus nisa Anopheles jintegraw dawn is-sinjali ormonali jista' jiffaċilita t-tfassil ta' programmi ġodda ta' kontroll tal-malarja. Hawnhekk, niżvelaw li dawn il-funzjonijiet riproduttivi huma regolati minn sterojdi sesswali distinti permezz ta' netwerk kumpless ta' enzimi li jattivaw/inattivaw l-ecdysteroid. Identifikajna ecdysone ossidizzat speċifiku għall-irġiel, 3-dehydro-20E (3D20E), li jipproteġi l-parentela billi jagħlaq ir-riċettività sesswali femminili wara trasferiment sesswali u attivazzjoni permezz ta' defosforilazzjoni. Notevolment, it-trasferiment ta' 3D20E wassal ukoll għall-espressjoni ta' ġeni riproduttivi li jżommu l-iżvilupp tal-bajd waqt l-infezzjoni tal-Plasmodium, u jiżguraw is-saħħa tan-nisa infettati. 20E derivat min-nisa ma jipprovokax infezzjoni sesswali rispons, iżda jippermetti lill-individwi li jkunu qed jitgħammru biex ibidu l-bajd wara li l-kinażi li jinibixxu 20E jiġu inibiti. L-identifikazzjoni ta' dan l-ormon sterojdi tal-insett speċifiku għall-irġiel u r-rwol tiegħu fir-regolazzjoni tar-riċettività sesswali femminili, il-fertilità u l-interazzjoni mal-Plasmodium tissuġġerixxi l-potenzjal li jitnaqqas is-suċċess riproduttiv tan-nemus li jittrażmettu l-malarja.
Il-każijiet u l-imwiet tal-malarja qed jiżdiedu mill-ġdid4 minħabba r-reżistenza mifruxa għall-insettiċidi fin-nemus Anopheles, l-uniku vettur tal-parassiti tal-malarja umana. Il-bijoloġija tat-tgħammir ta’ dawn in-nemus hija mira partikolarment attraenti għal interventi ġodda ta’ kontroll tal-malarja għaliex in-nisa jitgħammru darba biss5; li dan l-avveniment wieħed ta’ tgħammir isir sterili jkollu potenzjal kbir biex inaqqas il-popolazzjonijiet tan-nemus fil-qasam.
In-nisa jsiru sesswalment inkapaċitati wara li jirċievu ormoni sterojdi b'titru għoli mill-irġiel. Studji wrew li l-kawża tad-diffikultà fit-tgħammir ulterjuri hija 20-hydroxyecdysone (20E), ormon sterojdi magħruf aħjar bħala regolatur taċ-ċiklu tat-twaqqigħ tal-annimali fl-istadju tal-larva. Il-kapaċità tal-irġiel li jissintetizzaw u jittrasferixxu 20E evolviet speċifikament fl-ispeċi Anopheles li huma parti mis-sottoġeneru Cellia7, li huwa mqassam fl-Afrika u jinkludi l-aktar vetturi perikolużi tal-malarja, inkluż Anopheles gambiae. Dan huwa speċjalment notevoli għaliex f'dawn l-ispeċi n-nisa jipproduċu wkoll 20E wara kull ikla bid-demm, u 20E jmexxi ċ-ċiklu tal-ooġenesi (ara ref. 8). Madankollu, ftit li xejn huwa magħruf dwar il-mod kif in-nisa jintegraw sinjali minn żewġ sorsi differenti ta' ecdysone (trasferiment tal-irġiel u induzzjoni tat-tgħammir bid-demm) mingħajr ma jikkompromettu l-kapaċità tagħhom stess li jitgħammru. Fil-fatt, jekk l-20E prodott min-nisa jqanqal intolleranza sesswali, dan iwassal għal infertilità f'individwi li jreddgħu verġni, imġiba komuni ħafna f'dawn in-nemus5.
Spjegazzjoni possibbli hija li l-irġiel ta' A. gambiae jittrasferixxu ecdysone modifikata speċifika għall-irġiel, li tattiva kaskata ta' sinjalazzjoni fit-tratt riproduttiv femminili, li tirriżulta f'instabbiltà tat-tgħammir. Madankollu, għalkemm il-vertebrati għandhom diversi ormoni sterojdi, bħall-estroġenu u l-androġenu (riveduti fir-ref. 9), safejn nafu aħna, sterojdi b'preġudizzju androġeniku ma ġewx identifikati fl-insetti.
Iddeċidejna li niddeterminaw ir-repertorju ta' ormoni sterojdi fil-glandola aċċessorja maskili (MAG) ta' A. gambiae sesswalment matura fit-tfittxija ta' sterojdi modifikanti possibbli. Bl-użu ta' kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja flimkien ma' spettrometrija tal-massa tandem (HPLC-MS/MS) minflok il-metodu inqas speċifiku użat qabel, skoprejna ecdysone (E) u 20E f'dan it-tessut, u dan ikkonferma r-riżultat preċedenti. Madankollu, il-kampjun kien iddominat minn sterojdi fosforilati ossidizzati, konsistenti mal-formula 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (Figura 1). Forom oħra jinkludu 3-dehydro-20E (3D20E) u 20E-22-phosphate (20E22P). L-intensità tas-sinjal HPLC-MS/MS ta' 3D20E22P kienet żewġ ordnijiet ta' kobor ogħla mill-forma defosforilata tagħha, 3D20E, u tliet ordnijiet ta' kobor ogħla minn dik ta' E u 20E (Figura 1). Għalkemm f'partijiet oħra tal-ġisem u fil-parti t'isfel... apparat riproduttiv (LRT; Dejta Estiża Fig. 1a). Analizzajna wkoll ecdysteroids f'irġiel u nisa li għadhom kif ingħalqu (<1 jum) u skoprejna 3D20E u 3D20E22P biss fil-MAG; E, 20E u 20E22P kienu preżenti fiż-żewġ sessi (Dejta Estiża Fig. 1b). Din id-dejta tissuġġerixxi li l-irġiel adulti ta' A. gambiae jipproduċu titri għoljin ta' ormoni modifikanti fil-MAGs tagħhom li mhumiex sintetizzati min-nisa.
MAG u LRT femminili (inklużi atria, vesikoli seminali, u parovarium) ġew dissezzjonati minn irġiel verġni ta' 4 ijiem (4 ijiem) u nisa verġni u mgħammrin (0.5, 3, u 12 hpm). L-ecdysone f'dawn it-tessuti ġie analizzat permezz ta' HPLC-MS/MS (medja ± sem; t-test mhux imqabbel, żewġ naħat, rata ta' skoperta falza (FDR) ikkoreġuta; NS, mhux sinifikanti; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 sigħat vs. 0.5 sigħat, P = 0.035; 12-il siegħa vs. 3 sigħat, P = 0.0015; 12-il siegħa vs. 0.5 sigħat, P = 0.030. 3D20E22P: 3 sigħat vs. 0.5 sigħat, P = 0.25; 12-il siegħa vs. 3 sigħat, P = 0.0032; 12-il siegħa vs. 0.5 sigħat, P = 0.015). Id-dejta hija minn tliet repliki bijoloġiċi. L-erja tal-quċċata għal kull ecdysone ta' interess ġiet ikkalkulata u normalizzata bin-numru ta' nemus. L-ecdysone hija rappreżentata bil-kulur kif ġej: E, aħdar; 20E, oranġjo; 20E22P, vjola; 3D20E, blu; 3D20E22P, roża. L-inserzjoni żżid l-iskala fuq l-assi y biex turi livelli aktar baxxi ta' ecdysone.
Biex ninvestigaw jekk 3D20E22P u 3D20E jiġux trasferiti waqt it-tgħammir, iddissezzjonajna LRTs nisa f'diversi punti ta' żmien wara t-tgħammir. Għalkemm l-ecdysone ma nstabx fil-verġni, osservajna ammonti sostanzjali ta' 3D20E22P fl-LRT immedjatament wara t-tgħammir (0.5 sigħat wara t-tgħammir, hpm), li jonqsu maż-żmien, filwaqt li l-livelli ta' 3D20E żdiedu b'mod sinifikanti (Fig. 1). Bl-użu ta' 3D20E sintetizzat kimikament bħala standard, iddeterminajna li l-livelli ta' dan l-ormon sterojdi fl-LRTs tat-tgħammir kienu mill-inqas 100 darba ogħla minn 20E (Tabella ta' Dejta Estiża 1). Għalhekk, 3D20E22P huwa l-ecdysone maskili ewlieni li jiġi trasferit lill-LRT femminili waqt it-tgħammir, u l-forma defosforilata tiegħu, 3D20E, issir abbundanti ħafna ftit wara t-tgħammir. Dan jissuġġerixxi rwol importanti għall-aħħar ecdysone fil-bijoloġija ta' wara t-tgħammir femminili.
Wara li ġġenerajna sett ta' dejta ġdid ta' sekwenzar tal-RNA (RNA-seq) (Fig. 2a), bl-użu ta' pipeline tal-bijoinformatika mibni apposta, fittixna għal ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), u ecdysone li jikkodifika l-ġene tal-fosfatażi modifikat minn 20E. L-EPP) huwa espress fit-tessuti riproduttivi. Identifikajna ġene kandidat wieħed tal-EPP u żewġ ġeni potenzjali tal-EcK (EcK1 u EcK2), iżda ma stajniex insibu ġene kandidat tajjeb tal-EO. Notevolment, ġeni individwali tal-EPP ġew espressi f'livelli għoljin (98.9 perċentil) f'MAGs Gambjani iżda mhux f'LRTs femminili (Fig. 2b), kuntrarjament għall-aspettattivi tagħna peress li d-defosforilazzjoni ta' 3D20E22P seħħet f'dan it-tessut femminili. Għalhekk, nemmnu li l-EPP maskili jista' jiġi trasferit waqt it-tgħammir. Fil-fatt, użajna tikkettar ta' isotopi stabbli in vivo biex naħbu l-proteina femminili wara t-tgħammir, enzima identifikata permezz ta' MS fl-atriju femminili (Fig. 2c u Tabella Supplimentari 1). Il- Il-preżenza ta' EPP f'MAG u LRT femminili mgħammra (iżda mhux verġni) ġiet ikkonfermata wkoll bl-użu ta' antikorpi speċifiċi (Fig. 2d).
a, Pipeline bijoinformatiku mibni apposta biex ifittex fit-tessuti riproduttivi ta' kull sess għal ġeni li jikkodifikaw EcKs, EOs, u EPPs. In-numri ħdejn il-vleġeġ jindikaw in-numru ta' kandidati rġiel u nisa f'kull pass. Din l-analiżi identifikat ġene EPP wieħed (EPP) u ġene EcK wieħed (EcK1) li huma espressi fl-irġiel, u ġene EcK wieħed (EcK2) li huwa espress fiż-żewġ sessi iżda ma jagħtix ġene EO kandidat. b, Mappa tas-sħana li tqabbel l-espressjoni tal-ġene kandidat f'tessuti verġni (V) u tat-tgħammir (M) ta' Anopheles gambiae u Anopheles albicans. Spca, fertilizzazzjoni; MAGs, glandoli aċċessorji fl-irġiel; partijiet oħra tal-ġisem, inklużi sider, ġwienaħ, saqajn, korpi tax-xaħam, u organi interni fiż-żewġ sessi, u ovarji fin-nisa. EcK2 hija espressa ħafna kemm fil-MAG kif ukoll fl-atrija tal-Gambja, filwaqt li l-EPP tinsab biss fil-MAG. c, Analiżi proteomika tat-traslokazzjoni tal-grupp tal-ejakulat maskili fl-atrija femminili fi 3, 12 u 24 hpm, li turi s-67 proteina l-aktar abbundanti. In-nisa trabbew fuq dieta li fiha 15N biex tikkettja (u taħbi) il-proteini kollha. Irġiel mhux ittikkettati ġew imgħammra ma' nisa ttikkettati, u LRTs nisa ġew dissezzjonati fi 3, 12 u 24 hpm għall-analiżi proteomika (ara t-Tabella Supplimentari 1 għal lista kompluta ta' proteini ejakulatorji). Inset, EPP, Eck1 u EcK2 instabu fil-MAG ta' rġiel verġni permezz ta' analiżi proteomika ta' dawn it-tessuti. d, EPP instab permezz ta' western blot fil-MAG u LRT ta' nisa mgħammra, iżda mhux f'nisa verġni jew irġiel jew il-bqija tan-nisa ġisem. Il-membrani ġew sondati simultanjament b'antikorpi anti-actin (kontroll tat-tagħbija) u anti-EPP. L-irġiel kollha huma verġni. Ara l-Figura Supplimentari 1 għad-dejta tas-sors tal-ġel. Il-Western blots twettqu darbtejn b'riżultati simili.
L-attività tal-ekdisteroid fosfofosfatażi tal-EPP ġiet ivverifikata wara l-inkubazzjoni permezz ta' HPLC-MS/MS bi 3D20E22P iżolat minn MAG (Data Estiża Fig. 2a). Barra minn hekk, meta silenzjajna l-EPP permezz ta' interferenza medjata mill-RNA (RNAi), skoprejna tnaqqis qawwi fl-attività tal-fosfatażi fit-tessuti riproduttivi ta' dawn l-irġiel (Fig. 3a), u n-nisa mgħammra ma' rġiel silenzjati bl-EPP urew proporzjon aktar baxx sinifikanti ta' 3D20E defosforilat (Fig. 3b) minkejja silenzjar parzjali tal-ġeni (Data Estiża Fig. 2b,c). B'kuntrast, ma skoprejna l-ebda bidliet sinifikanti fil-proporzjon 20E22P/20E fl-istess nemus, li jista' jissuġġerixxi li l-enzima hija speċifika għal 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Tnaqqis fl-attività tal-fosfatażi fil-MAG ikkawżat minn silencing tal-EPP bl-użu ta' kontrolli tal-RNA tal-EPP b'żewġ linji (dsEPP) jew kontrolli tal-RNA tal-GFP b'żewġ linji (dsGFP). Għoxrin grupp ta' MAG intużaw f'kull replika (P = 0.0046, test-t imqabbad, żewġ naħat), rappreżentati minn tikek separati.b, Nisa mgħammra ma' rġiel silenċjati bl-EPP kellhom proporzjon sinifikament aktar baxx ta' 3D20E defosforilat fi 3 hpm (P = 0.0043, test-t mhux imqabbad, żewġ naħat), filwaqt li l-livelli ta' 20E ma ġewx affettwati (P ​​= 0.063, mhux imqabbad). t-test, żewġ naħat). Id-dejta hija ppreżentata bħala medja ± sem minn tliet gruppi ta' 13, 16 u 19-il mara kull wieħed.c, In-nisa mgħammra ma' rġiel silenzjati bl-EPP kellhom rati sinifikament ogħla ta' tgħammir mill-ġdid (P = 0.0002, test eżatt ta' Fisher, żewġ naħat). In-nisa l-ewwel ġew sfurzati jitgħammru biex jiġi żgurat l-istatus ta' tgħammir tagħhom; Jumejn wara, ġew ikkuntattjati ma' rġiel oħra li jġorru sperma transġenika biex jiġu vvalutati r-rati ta' tgħammir mill-ġdid permezz ta' skoperta kwantitattiva tal-PCR tat-transġene.d, Nisa mitmugħa bid-demm imgħammra ma' rġiel silenzjati bl-EPP kellhom fertilità mnaqqsa b'mod sinifikanti (P ​​< 0.0001; test Mann-Whitney, żewġ naħat) u numru ta' bajd xi ftit imnaqqas (P = 0.088, test Mann-Whitney, żewġ naħat), filwaqt li r-rata tat-tbid ma ġietx affettwata (P = 0.94, test eżatt ta' Fisher, żewġ naħat).Fil-pannelli kollha, n tirrappreżenta n-numru ta' kampjuni tan-nemus bijoloġikament indipendenti.NS, mhux sinifikanti.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Sussegwentement, ivvalutajna jekk id-defosforilazzjoni tal-ekdisone hijiex importanti biex tinduċi reżistenza għat-tgħammir fin-nisa. Notevolment, in-nisa tgħammru ma' rġiel imnaqqsa mill-EPP reġgħu tgħammru bi frekwenza ħafna ogħla (44.9%) min-nisa ta' kontroll (10.4%) meta ġew esposti għal irġiel (transġeniċi) addizzjonali (Fig. 3c). Osservajna wkoll tnaqqis sinifikanti fil-fertilità (Fig. 3d, xellug) u tnaqqis żgħir fin-numru ta' bajd imqiegħed minn dawn in-nisa (Fig. 3d, fin-nofs), filwaqt li l-perċentwal ta' bajd imqiegħed min-nisa (rispons ieħor imqanqal fin-nisa permezz tat-tgħammir)) ma ġiex affettwat (Fig. 3d, lemin). Minħabba l-ispeċifiċità osservata tal-EPP għal 3D20E22P, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-attivazzjoni ta' 3D20E mill-EPP trasferit waqt it-tgħammir jista' jkollha rwol importanti fit-tifi tar-riċettività tan-nisa għal aktar tgħammir, imġiba li qabel kienet attribwita lit-trasferiment sesswali ta' 20E. Għalhekk, dan l-ormon speċifiku għall-irġiel jaffettwa wkoll bil-qawwa l-fertilità tan-nisa.
Sussegwentement, qabbilna l-attivitajiet ta' 20E u 3D20E f'esperimenti ta' injezzjoni f'verġni sesswalment maturi bl-użu ta' 3D20E sintetizzat kimikament (Fig. 4a–c) u 20E disponibbli kummerċjalment. Osservajna li 3D20E kien sinifikament aktar effettiv minn 20E fit-tnaqqis tas-sensittività tan-nisa għat-tgħammir fiż-żewġ konċentrazzjonijiet (Fig. 4d). Notevolment, nofs il-livell fiżjoloġiku ta' 3D20E fl-LRT (1,066 pg wara l-injezzjoni vs. 2,022 pg wara t-tgħammir) wassal għal proporzjon ta' nisa refrattorji li kien 20 darba ogħla mil-livell fiżjoloġiku ta' 20E (361 pg wara l-injezzjoni) 24 siegħa wara l-injezzjoni bl-ogħla konċentrazzjoni 18 pg wara t-tgħammir; Tabella ta' Dejta Estiża 1). Dan ir-riżultat huwa konsistenti man-nozzjoni li t-trasferiment sesswali ta' 20E ma jikkawżax perjodi refrattorji ta' tgħammir, u jindika wkoll li 3D20E huwa fattur ewlieni biex tiġi żgurata r-relazzjoni bejn il-ġenitur u t-tifel/tifla. 3D20E kien ukoll sinifikament aktar attiv minn 20E f'assaġġi tat-tbid tal-bajd f'nisa verġni (Fig. 4e), li jissuġġerixxi li r-rata normali tat-tbid tal-bajd li osservajna wara s-silenċjar parzjali tal-EPP kienet dovuta għall-preżenza ta' attività residwa ta' 3D20E li għadha prodotta minn fatturi femminili indotti mit-tgħammir.
(a,b) 3D20E sintetizzat kimikament minn 20E (a) b'konverżjoni/effiċjenza għolja ħafna (dejta ppreżentata bħala medja ± sem minn tliet reazzjonijiet ta' sinteżi indipendenti) (b).c, L-ispettru tal-massa (in-nofs t'isfel) jaqbel eżattament mal-ecdysone misjub f'LRT femminili mgħammra (in-nofs ta' fuq).d, Imqabbel ma' 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; test eżatt ta' Fisher, b'żewġ naħat) u 10% etanol (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; test eżatt ta' Fisher, b'żewġ naħat), filwaqt li 20E kien sinifikament ogħla mill-kontroll biss f'dożi ogħla (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; test eżatt ta' Fisher, b'żewġ naħat).e, 3D20E L-injezzjoni wasslet għal rati ta’ tnissil sinifikament ogħla f’nisa verġni milli fil-kontrolli b’10% etanol (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; test eżatt ta’ Fisher, b’żewġ naħat), filwaqt li 20E meta mqabbel mal-kontrolli biss f’dożi ogħla (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; test eżatt ta’ Fisher, b’żewġ naħat).3D20E wasslet għal rati ta’ tnissil sinifikament ogħla minn 20E f’dożi ogħla (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; test eżatt ta’ Fisher, b’żewġ naħat).Fil-pannelli kollha, n tirrappreżenta n-numru ta’ kampjuni tan-nemus bijoloġikament indipendenti.NS, mhux sinifikanti.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Id-dejta hija minn tliet repliki.
Fi studji preċedenti, iddeterminajna li t-trasferiment sesswali ta' ormoni sterojdi jikkaġuna l-espressjoni ta' MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), ġene riproduttiv femminili li jipproteġi lin-nisa ta' A. gambiae mill-infezzjoni ta' P. falciparum. Spejjeż tas-saħħa kkawżati minn 13, l-aktar parassita qattiela tal-malarja umana. Minħabba l-importanza ta' MISO għall-idoneità riproduttiva ta' Anopheles f'żoni endemiċi tal-malarja, iddeċidejna li niddeterminaw liema ormon 3D20E jew 20E jqanqal l-espressjoni ta' dan il-ġene. Sibna li filwaqt li l-injezzjoni ta' 20E speċifikament jew b'mod aktar qawwi induċiet xi riċetturi ta' ormoni nukleari (HR), bħal HR3 u HR4, u miri sterojdi downstream tipiċi, bħall-ġeni yolkogeniċi Vg14, 15, 16, MISO kien indott b'mod aktar qawwi minn 3D20E (Data Estiża Fig. 3). Għalhekk, it-trasferiment sesswali ta' dan l-ormon sterojdi androġeniku jidher li jikkaġuna mekkaniżmi li jipproteġu lin-nisa mill-ispejjeż ikkawżati mill-infezzjoni parassitika. Barra minn hekk, 3D20E jaffettwa b'mod differenti kemm isoformi tar-riċettur E EcR, li jinduċu EcR-A u jrażżnu EcR-B, u b'mod aktar qawwi jqanqlu ġeni oħra li jinduċu t-tgħammir, inkluż HPX15, li jaffettwa l-fertilità femminili. Dan jista' jispjega l-infertilità sinifikanti osservata fin-nisa mgħammra ma' rġiel silenzjati bl-EPP (Dejta Estiża Fig. 3). Din id-dejta tissuġġerixxi l-eżistenza ta' mogħdijiet downstream attivati ​​preferenzjalment minn żewġ ormoni ecdysone li jistgħu jkunu l-bażi tal-funzjoni speċifika għas-sess.
Sussegwentement, ittestjajna l-funzjoni taż-żewġ ġeni EcK identifikati fil-pipeline tal-bijoinformatika tagħna. Is-silenċjar ta' EcK1 jew EcK2 irriżulta f'mortalità sinifikanti fl-irġiel (Data Estiża Fig. 4a), li jissuġġerixxi li l-fosforilazzjoni tal-ecdysone, u għalhekk l-inattivazzjoni, hija importanti għas-sopravivenza. Minħabba li EcK2 ġie espress f'livelli ogħla minn EcK1 u ġie skopert f'MAGs permezz tal-proteomika (Fig. 2b,c u Tabella Supplimentari 2), ivvalidajna l-attività tal-kinażi ecdysteroid tagħha billi inkubajnieha ma' 20E, li rriżultat fil-fosforilazzjoni ta' 20E22P (Data Estiża Figura 2).4b). Meta użajna 3D20E bħala sottostrat, ma stajniex niskopru l-prodott fosforilat 3D20E22P (Data Estiża Fig. 4c), li jissuġġerixxi li 20E aktar milli 3D20E jista' jkun il-mira preferuta ta' EcK2.
Skont l-analiżi RNA-seq tagħna, EcK2 kien ukoll espress ħafna fl-LRT ta' nisa verġni, fejn kien mitfi wara t-tgħammir (Fig. 2b). Aħna kkonfermajna din id-dejta u ddeterminajna li l-espressjoni ta' EcK2 ma kinitx affettwata mit-tmigħ bid-demm (Dejta Estiża Fig. 5a). Billi estendejna l-esperimenti MS inizjali tagħna, iddeterminajna li l-quċċata ta' 20E22P kienet relatata mill-qrib mal-quċċata ta' 20E (22-26 siegħa wara l-ikel bid-demm; Dejta Estiża Fig. 5b). Is-silenċjar ta' EcK2 f'nisa verġni rriżulta f'żieda ta' 3 darbiet fil-proporzjon relattiv ta' 20E għal 20E22P 26 siegħa wara l-ikel bid-demm (Figuri ta' Dejta Estiża 2c u 5c), li jikkonferma li EcK2 jiffosforila wkoll 20E fin-nisa. Notevolment, verġni mnaqqsa minn EcK2 żammew riċettività sesswali sħiħa (Dejta Estiża Fig. 5d,e), li jissuġġerixxi aktar li l-produzzjoni femminili ta' 20E ma tinduċix perjodi refrattorji ta' tgħammir. Madankollu, dawn in-nisa kellhom rati ta' tbid tal-bajd żdiedu b'mod sinifikanti meta mqabbla mal-kontrolli, b'aktar minn 30% tal-verġni jbidu l-bajd (Data Estiża Fig. 5f). Jekk injezzjonijiet ta' Eck2 RNA b'żewġ linji (dsEcK2) twettqu wara t-tmigħ bid-demm, it-tbid ma seħħx, f'liema punt il-quċċata ta' 20E minħabba l-inġestjoni tad-demm kienet naqset. B'mod ġenerali, dawn ir-riżultati jappoġġjaw mudell li 20E prodott wara l-irdigħ tad-demm jista' jikkaġuna t-tbid, iżda biss meta l-blokk tat-tbid (EcK2 u possibilment fatturi oħra) jintefa bit-tgħammir. La l-injezzjonijiet ta' 20E u lanqas dawk ta' 3D20E ma inibixxu l-espressjoni ta' EcK2 fil-verġni (Data Estiża Fig. 5g), li jissuġġerixxi li fatturi oħra jimmedjaw l-inibizzjoni ta' din il-kinażi. Madankollu, il-livelli ta' 20E wara t-tmigħ bid-demm ma kinux biżżejjed biex jikkaġunaw skumdità fit-tgħammir, iżda kienu effettivament attivati ​​minn titri għoljin ta' 3D20E trasferit sesswalment.
Ir-riżultati tagħna jipprovdu għarfien importanti dwar il-mekkaniżmi li jirregolaw is-suċċess riproduttiv ta' A. gambiae. Ħareġ mudell fejn l-irġiel evolvew biex jissintetizzaw titri għoljin ta' 3D20E, ecdysone modifikat speċifiku għall-irġiel li jiżgura l-parentela billi jiddesensibilizza lin-nisa għal aktar tgħammir. Fl-istess ħin, dawn il-vetturi tal-malarja evolvew ukoll sistema effiċjenti biex jattivaw 3D20E fin-nisa b'reazzjoni għat-trasferiment sesswali ta' EPP speċifiku għall-irġiel. Sa fejn nafu aħna, dan huwa l-ewwel eżempju ta' sistema ta' ormoni sterojdi dominati mill-irġiel u n-nisa li twettaq funzjoni unika u kritika fl-insetti. Il-funzjoni ta' ecdysone speċifika għall-irġiel ġiet postulata iżda mhux murija b'mod definittiv. Pereżempju, ipoteżi 18 li fil-biċċa l-kbira ġiet miċħuda hija li dawn il-funzjonijiet jistgħu jitwettqu mill-prekursur 20E E1. Huwa magħruf sew li f'Drosophila, il-monandrija hija attivata mit-trasferiment sesswali ta' peptidi sesswali żgħar 19,20 li jinteraġixxu man-newroni li jinnervaw it-tratt riproduttiv femminili permezz ta' riċetturi speċifiċi tal-peptidi sesswali 21,22. Huwa meħtieġ aktar xogħol biex jiġu ddeterminati l-kaskati tas-sinjalar downstream. ikkontrollat ​​minn 3D20E f'nisa ta' A. gambiae u biex jiġi determinat jekk dawn il-kaskati jistgħux jiġu kkonservati bejn in-nemus u d-Drosophila.
Minħabba r-rwol importanti ta' 3D20E fuq il-fertilità u l-imġieba femminili identifikati fl-istudju tagħna, il-mogħdijiet li jwasslu għas-sintesi u l-attivazzjoni ta' 3D20E joffru opportunitajiet ġodda għal strateġiji futuri għall-kontroll tan-nemus, bħall-ġenerazzjoni ta' rġiel sterili kompetittivi fi strateġiji tat-teknoloġija tal-insetti sterili. Użu għar-rilaxx selvaġġ jew biex jimitaw it-3D20E fil-logħob verġni. Il-funzjoni speċifika għall-irġiel ta' 3D20E setgħet evolviet meta A. gambiae u speċi oħra ta' Cellia akkwistaw il-ħila li jikkoagulaw l-isperma tagħhom fi tappijiet tat-tgħammir, peress li dan jippermetti t-trasferiment effiċjenti ta' numru kbir ta' ormoni u enzimi li jattivaw l-ormoni. Min-naħa tagħha, l-evoluzzjoni ta' 3D20E li timplimenta l-monandrija tipprovdi mekkaniżmu għan-nisa (permezz ta' espressjoni għolja ta' MISO) biex jiffavorixxu l-idoneità riproduttiva tagħhom f'żoni ta' prevalenza għolja ta' malarja, li indirettament tikkontribwixxi għat-trażmissjoni tal-Plasmodium. Minħabba li ntwera li 20E femminili għandu effetti profondi fuq is-sopravivenza u t-tkabbir ta' P. falciparum fin-nemus Anopheles femminili,24 kemm il-mogħdijiet tal-ormoni sterojdi maskili kif ukoll femminili issa huma aspetti ewlenin tal-interazzjonijiet nemus-parassita.
Ir-razez A. gambiae G3 trabbew taħt kundizzjonijiet standard tal-insetti (26-28 °C, umdità relattiva ta' 65-80%, fotoperjodu ta' dawl/dlam ta' 12:12 siegħa). Il-larvi ngħataw ikel tal-ħut fi trab (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets u Tetra Pond Sticks fi proporzjon ta' 7:7:2). In-nemus adulti ngħataw soluzzjoni ta' 10% destrosju ad libitum u demm uman kull ġimgħa (studjaw il-komponenti tad-demm). In-nemus verġni nkiseb billi s-segregazzjoni tas-sessi fl-istadju tal-pupa ġiet eżaminata t-truf bil-mikroskopija. L-irġiel li jġorru t-transġene DsRed ġew deskritti qabel.
Esperimenti ta' tgħammir furzat twettqu skont protokolli deskritti qabel. Għat-tgħammir naturali, nisa verġni ta' 4 ijiem inżammu fi proporzjon ta' 1:3 ma' rġiel verġni sesswalment maturi għal żewġ iljieli. Għal esperimenti li fihom l-irġiel ġew injettati b'dsEPP, it-tqegħid f'gaġġa konġunta kkoinċidiet mal-jiem 3-4 wara l-injezzjoni, meta l-attività tal-fosfatażi kienet silenzjuża bl-aktar mod possibbli (Fig. 2b tad-Data Estiża).
It-tessuti tan-nemus, il-kadavri li kien fadal (il-bqija tal-ġisem), jew il-ġisem kollu ġew dissezzjonati f'100% metanol u omoġenizzati b'beader (żibeġ tal-ħġieġ ta' 2 mm, 2,400 rpm, 90 sekonda). L-ammonti ta' tessuti u l-volumi tal-metanol kienu kif ġej: il-bqija tal-ġisem, 50 f'1,000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT femminili, 25–50 80 µl. Il-preċipitat ġie soġġett għal tieni estrazzjoni tal-metanol bl-istess volum ta' metanol. Il-fdalijiet taċ-ċelluli tneħħew permezz ta' ċentrifugazzjoni. Il-metanol miż-żewġ estrazzjonijiet ġie kkombinat u mnixxef taħt fluss ta' nitroġenu, imbagħad ġie sospiż mill-ġdid fil-volumi li ġejjin ta' 80% metanol fl-ilma: il-bqija tal-ġisem, 50 µl; MAGs u LRT femminili, 30 µl.
Il-kampjuni ġew analizzati fuq spettrometru tal-massa (ID-X, Thermo Fisher) akkoppjat ma' strument LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl tal-kampjun ġew injettati fuq kolonna ta' 3 µm, 100 × 4.6 mm (Inspire C8, Dikma) miżmuma f'25 °C. Il-fażijiet mobbli għall-LC kienu A (ilma, 0.1% aċidu formiku) u B (aċetonitrile, 0.1% aċidu formiku). Il-gradjent tal-LC kien kif ġej: 5% B għal minuta, imbagħad żdied għal 100% B fuq 11-il minuta. Wara 8 minuti f'100%, erġa' ekwilibra l-kolonna f'5% B għal 4 minuti. Ir-rata tal-fluss kienet 0.3 ml min-1. L-jonizzazzjoni fis-sors MS titwettaq permezz ta' jonizzazzjoni bl-elettrosprej imsaħħan f'modi pożittivi u negattivi.
L-ispettrometru tal-massa jkejjel id-dejta fil-medda m/z minn 350 sa 680 b'riżoluzzjoni ta' 60,000 fil-modalità MS sħiħa. Id-dejta MS/MS inkisbet fuq [M + H]+ (il-miri kollha), [M - H2O + H]+ (il-miri kollha), u [M - H]- (miri fosforilati). Id-dejta MS/MS intużat biex tikkonferma l-proprjetajiet tal-ecdysone tal-miri li għalihom ma kien hemm l-ebda standard disponibbli. Biex jiġu identifikati ecdysterojdi mhux immirati, ġiet analizzata d-dejta MS/MS għall-qċaċet kollha tal-HPLC b'abbundanza relattiva ta' >15%. Ikkwantifika bl-użu ta' kurvi standard maħluqa minn standards puri (20E, 3D20E) biex tikkalkula l-ammonti assoluti jew id-dilwizzjonijiet ta' kampjun speċifiku wieħed (il-miri l-oħra kollha) biex tikkalkula l-ekwivalenza tagħhom għall-ammonti misjuba f'raġel wieħed. Għal 3D20E, il-kwantifikazzjoni twettqet bl-użu tas-somma tal-addotti li ġejjin: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Id-dejta ġiet estratta u kwantifikata bl-użu ta' Tracefinder (verżjoni 4.1).Id-dejta MS/MS ġiet analizzata bl-użu ta' Xcalibur (verżjoni 4.4).L-ispettri MS ta' E, 20E u 3D20E tqabblu mal-istandards rispettivi.3D20E22P ġie analizzat permezz ta' derivatizzazzjoni bir-reaġent ta' Girard.20E22P ġie analizzat permezz tal-proporzjon m/z.
3D20E22P ġie ppurifikat minn MAG. Il-purifikazzjoni twettqet fuq skala analitika bl-użu ta' kromatografu likwidu ta' prestazzjoni ultra (Acquity, Waters) b'ditekter ibbażat fuq il-massa quadrupole (QDa, Acquity, Waters) taħt l-istess kundizzjonijiet LC bħall-analiżi HPLC-MS/MS. Il-ġbir tal-frazzjonijiet ġie attivat meta l-m/z li jikkorrispondi għal 3D20E22P ġie skopert fl-istess ħin ta' żamma kif determinat qabel. Il-purità tal-komposti estratti mbagħad ġiet iċċekkjata permezz ta' HPLC-MS/MS kif deskritt hawn fuq.
L-RNA totali ġie estratt minn 10-12-il tessut riproduttiv jew partijiet oħra tal-ġisem (bla ras) bl-użu tar-reaġent TRI (Thermo Fisher) wara l-istruzzjonijiet tal-manifattur. L-RNA ġie ttrattat b'TURBO DNase (Thermo Fisher). Is-cDNA ġie sintetizzat bl-użu tar-reverse transcriptase tal-virus tal-lewkimja murina Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) wara l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-primers għall-PCR kwantitattiva tat-traskrizzjoni inversa (RT-qPCR; Tabella tad-Data Estiża 2) ġew ippubblikati qabel24 jew iddisinjati bl-użu ta' Primer-BLAST26, bi preferenza mogħtija lil prodotti ta' daqs ta' 70-150 bp u li jkopru ġunzjonijiet exon-exon jew primers ta' pari ta' primers exons separati. Kampjuni tas-cDNA minn tlieta sa erba' repliki bijoloġiċi ġew dilwiti erba' darbiet fl-ilma għal RT-qPCR. Il-kwantifikazzjoni twettqet f'reazzjonijiet replikati ta' 15 µl li fihom 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primers, u 5 µl ta' cDNA dilwit. Ir-reazzjonijiet tmexxew fuq QuantStudio 6 Pro Sistema PCR f'ħin reali (Thermo Fisher) u d-dejta nġabret u ġiet analizzata bl-użu ta' Design and Analysis (verżjoni 2.4.3). Kif muri f'dan l-istudju, l-ammonti relattivi ġew normalizzati għall-ġene ribosomali RpL19 (AGAP004422), li l-espressjoni tiegħu ma nbidlitx b'mod sinifikanti bit-tmigħ tad-demm 27 jew bit-tgħammir 3.
Il-kwalità tal-RNA ġiet iċċekkjata bl-użu ta' Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Il-libreriji Illumina paired-end ġew ippreparati u mħaddma fil-Broad Institute tal-MIT u Harvard. Il-qari tas-sekwenzar ġie allinjat mal-ġenoma ta' A. gambiae (razza PEST, verżjoni 4.12) bl-użu ta' HISAT2 (verżjoni 2.0.5) b'parametri default. Il-qari b'punteġġi ta' kwalità tal-immappjar (MAPQ) <30 tneħħa bl-użu ta' Samtools (verżjoni 1.3.1). In-numru ta' qari mmappjat għall-ġeni ġie magħdud bl-użu ta' htseq-count (verżjoni 0.9.1) b'parametri default. L-għadd ta' qari normalizzat ġie kkalkulat u l-espressjoni differenzjali tal-ġeni ġiet analizzata bl-użu tal-pakkett DESeq2 (verżjoni 1.28.1) f'R (verżjoni 4.0.3).
Il-kandidati tal-ġeni li jimmodifikaw l-ecdysone ġew identifikati billi l-ewwel fittxew il-ġenoma ta' A. gambiae bl-użu tal-algoritmu PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), bl-użu ta' valuri awtomatiċi Parametri bis-sekwenzi tal-proteini tal-mistoqsija li ġejjin: minn Bombyx mori (Numru ta' Aċċessjoni NP_001038956.1), Musca domestica (Numru ta' Aċċessjoni XP_005182020.1, XP_005175332.1 u XP_011294434.1) u Microplitis demolitor (Numru ta' Aċċessjoni XP_008552646.1 u XP_008552645.1) EcK minn B. mori (Numru ta' Aċċessjoni NP_001036900), Drosophila melanogaster (Numru ta' Aċċessjoni NP_651202), Apis mellifera (Numru ta' Aċċessjoni XP_394838) u Acyrthosiphon pisum (Numru ta' Aċċessjoni XP_001947166); u EPP minn B. mori (Numru ta' Aċċessjoni XP_001947166) NP_001177919.1 u NP_001243996.1) u EO ta' D. melanogaster (Numru ta' Aċċessjoni NP_572986.1) (pass 1). Imbagħad, iffiltra r-riżultati bbażati fuq espressjoni għolja ta' mRNA (>100 framment/kilobażi exons għal kull miljun mapped reads (FPKM) jew >85%) f'tessut riproduttiv (LRT femminili jew MAG) fil-Gambja (pass 2). Biex intejbu l-ispeċifiċità, għażilna enzimi kandidati li huma espressi wkoll fit-tessut riproduttiv ta' A. albimanus, speċi ta' anopheles li ma tissintetizzax jew tittrasferixxi ecdysone waqt it-tgħammir. Il-ġeni kandidati ġew iffiltrati abbażi ta' espressjoni baxxa (<100 FPKM jew <85 perċentil) fit-tessut riproduttiv ta' A. albimanus (pass 3). Bħala filtru finali (pass 4), il-ġeni kandidati jeħtieġ li jissodisfaw mill-inqas waħda minn dawn li ġejjin: (1) regolati 'l fuq b'mod sinifikanti wara t-tgħammir (P < 0.05) skont l-analiżi tal-ġeni espressi b'mod differenzjali u (2) f'tessuti mhux riproduttivi (< 85 % jew <100 FPKM).
Aħna mmodifikajna l-metodi deskritti qabel 28,29,30 biex niksbu t-tikkettar iżotopiku tal-organiżmu sħiħ. Fil-qosor, Saccharomyces cerevisiae tat-tip selvaġġ tat-tip II (YSC2, Sigma) ġie ttestjat f'bażi ​​tan-nitroġenu tal-ħmira (BD Difco, DF0335) li fiha (piż/vol) 2% glukożju (G7528, Sigma), 1.7% mingħajr amino aċidi u sulfat tal-ammonju. mezz ta' kultura) u 5% 15N sulfat tal-ammonju (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) bħala l-uniku sors ta' nitroġenu. Il-ħmira ġiet irkuprata permezz ta' ċentrifugazzjoni u l-larva tan-nemus ingħatat l-għalf ad libitum sakemm saret pupa. Issupplimentajt b'ikel tal-ħut (0.5 mg għal kull 300 larva) biex tipprevjeni l-mortalità fir-raba' stadju. Imbagħad intużaw biss in-nisa f'esperimenti ta' tgħammir ma' rġiel mhux ittikkettati biex jiġi analizzat il-proteoma maskili trasferita waqt it-tgħammir.
Nisa verġni ta' 4-6 ijiem b'tikketta 15N ġew sfurzati jitgħammru ma' rġiel verġni mhux ittikkettati tal-istess età. It-tgħammir b'suċċess ġie vverifikat billi ġew skoperti tappijiet tat-tgħammir taħt mikroskopija tal-epifluworexxenza. Fi 3, 12, u 24 hpm, l-atrija ta' 45-55 mara mgħammra ġew dissezzjonati f'50 µl ta' buffer tal-bikarbonat tal-ammonju (pH 7.8) u omoġenizzati b'pestle. L-omoġenat ġie ċċentrifugat u s-supernatant imħallat ma' 50 µl ta' 0.1% RapiGest (186001860, Waters) f'50 mM bikarbonat tal-ammonju. Is-supernatant u l-gerbub minn kull kampjun ġew iffriżati malajr fuq silġ niexef u ntbagħtu matul il-lejl lejn il-laboratorju MacCoss fl-Università ta' Washington, fejn tlestiet il-preparazzjoni tal-kampjun għal LC-MS/MS. Erġa' ssospendi l-gerbub f'50 µl ta' 0.1% RapiGest f'50 mM bikarbonat tal-ammonju u sonikat f'banju tal-ilma. Il-konċentrazzjoni tal-proteina tal-gerbub u s-supernatant ġiet imkejla bl-assaġġ BCA, il-kampjuni tnaqqsu b'5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma), alkilati b'15 mM iodoacetamide (Sigma) u inkubati f'temperatura ta' 37 °C (1:0 50) għal siegħa b'proporzjon ta' tripsinizzazzjoni: tripsina: sottostrat). RapiGest ġie liżat biż-żieda ta' 200 mM HCl, segwit minn inkubazzjoni f'temperatura ta' 37 °C għal 45 minuta u ċentrifugazzjoni f'14,000 rpm għal 10 minuti f'temperatura ta' 4 °C biex jitneħħew id-debris. Il-kampjuni nħaslu b'estrazzjoni ta' fażi solida b'modalità dual (cartridges Oasis MCX, Waters) u ġew sospiżi mill-ġdid f'0.1% aċidu formiku għal konċentrazzjoni finali tal-proteina ta' 0.33 µg µl-1. Proteomi MAG mhux ittikkettati ġew analizzati bl-istess mod minn irġiel verġni. Żewġ repliki analitiċi ġew analizzati għal kull kampjun. Imbagħad, 1 µg ta' kull wieħed ġie analizzat bl-użu ta' kolonna ta' silika mdewba ta' 25 ċm u 75 μm b'nassa ta' frit Kasil1 (PQ) ta' silika mdewba ta' 4 ċm ippakkjata b'reżina ta' fażi inversa Jupiter C12 (Phenomenex) u kromatografija likwida ta' 180 minuta. Diġestjonijiet ta' kampjuni – MS/MS tħaddem fuq spettrometru tal-massa Q-Exactive HF (Thermo Fisher) b'Sistema nanoACQUITY UPLC (Waters). Id-dejta tal-akkwist relatata mad-dejta ġġenerata għal kull ġirja ġiet konvertita għal format mzML bl-użu ta' Proteowizard (verżjoni 3.0.20287) u bl-użu ta' Comet31 (verżjoni 3.2) kontra d-database FASTA li fiha sekwenzi ta' proteini minn Anopheles gambiae (VectorBase verżjoni 54), Anopheles coluzzi. Twettqet tfittxija fuq Mali-NIH (VectorBase verżjoni 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Marzu 2021), A. gambiae RNA-seq, u traduzzjonijiet ta' tliet frejms ta' kontaminanti umani magħrufa. L-FDRs imqabbla mal-mappa tal-peptidi ġew determinati bl-użu ta' Percolator32 (verżjoni 3.05) b'limitu ta' 0.01, u l-peptidi ġew immuntati f'identifikazzjonijiet ta' proteini bl-użu tal-parsimonja tal-proteini f'Limelight33 (verżjoni 2.2.0). Proteina relattiva L-abbundanza ġiet stmata bl-użu tal-fattur tal-abbundanza spettrali normalizzat (NSAF) ikkalkulat għal kull proteina f'kull ġirja kif deskritt qabel. L-NSAF relattiv għal kull proteina ġie medjat bejn kampjuni minn żewġ repliki bijoloġiċi differenti. It-tikkettar 15N ħeba b'suċċess il-proteoma femminili, għalkemm ammont żgħir ta' proteina mhux immarkata seta' jiġi skopert mill-verġni mmarkati. Irreġistrajna skoperta ta' tnaqqis fil-proteina maskili (1-5 spettri) f'kampjuni mhux ipproċessati femminili biss f'ġirjiet tekniċi, fejn kampjuni mhux ipproċessati tmexxew wara kampjuni maskili/ta' tgħammir, bħala riżultat ta' "carry over" tal-HPLC. Proteini okkażjonali misjuba bħala 'kontaminanti' minn verġni mmarkati huma elenkati fit-Tabella Supplimentari 1.
Żewġ peptidi antiġeniċi, QTTDRVAPAPDQQQ (fl-isotip PA) u MESDGTTPSGDSEQ (fl-isotip PA u PB) f'Genscript. Iż-żewġ peptidi ġew ikkombinati, imbagħad konjugati mal-proteina trasportatriċi KLH u injettati fil-fniek ta' New Zealand. Il-fniek ġew sagrifikati wara r-raba' injezzjoni, u l-IgG totali ġiet iżolata permezz ta' purifikazzjoni tal-affinità. IgG mill-fenek l-aktar speċifiku għall-EPP intuża għal aktar western blotting.
Għal western blots, MAG (n = 10, fejn n tirrappreżenta n-numru ta' kampjuni tan-nemus bijoloġikament indipendenti) u LRT femminili (n = 30) minn irġiel verġni ta' 4 ijiem u nisa verġni jew imgħammra bil-forza (<10 wara t-tgħammir), Buffer tal-estrazzjoni tal-proteini (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% sodium deoxycholate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× cocktail ta' inibituri tal-protease (Roche)) ġie miżjud separatament. Il-kampjuni ġew omoġenizzati immedjatament wara d-dissezzjoni b'beader (żibeġ tal-ħġieġ ta' 2 mm, 2,400 rpm, 90 sek). Id-debris li ma jinħallx tneħħa permezz ta' ċentrifugazzjoni f'20,000 g f'4 °C. Il-proteini ġew kwantifikati permezz ta' Bradford assay (Bio-Rad). Imbagħad, 20 µg ta' proteina MAG, 40 µg ta' proteina LRT, u 20 µg ta' proteina bl-ingrossa residwa. ġew denaturati u separati b'10% Bis-Tris NuPAGE bl-użu ta' buffer MOPS. Il-proteini ġew trasferiti għal membrani tal-polivinilidene fluoride bl-użu tas-sistema ta' trasferiment iBlot2 (Thermo Fisher). Il-membrani nħaslu darbtejn f'1× PBS-T (0.1% Tween-20 f'PBS) u mbagħad imblukkati f'Odyssey blocking buffer (Li-Cor) għal siegħa f'22°C. Il-membrani tħawdu matul il-lejl f'4°C b'antikorp primarju poliklonali tal-fenek anti-EPP apposta (1:700 f'buffer ta' imblukkar) u antikorp primarju monoklonali tal-firien anti-actin MAC237 (Abeam; 1:4,000). Il-membrani nħaslu bil-PBS-T u mbagħad inkubati b'antikorpi sekondarji (ħmar anti-fenek 800CW u mogħża anti-firien 680LT (Li-Cor), it-tnejn 1:20,000) f'buffer ta' imblukkar li kien fih 0.01% SDS u 0.2% Tween-20 għal siegħa. siegħa f'22 °C. Il-membrani nħaslu bil-PBS-T u ġew immaġinati bi skaner Odyssey CLx. L-immaġnijiet inġabru u ġew ipproċessati f'Image Studio (verżjoni 5.2). Ma nstabitx faxxa speċifika li tikkorrispondi għall-isoforma EPP-RA (82 kDa).
Ir-reġjuni kodifikanti tal-EPP (bħala isoforma AGAP002463-RB li fiha d-dominju tal-istidina fosfatażi, tfittxija tad-dominju kkonservat tal-NCBI 34) u EcK2 (AGAP002181) ġew ikklonati fil-plasmid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Il-primers huma elenkati fit-Tabella 2 tad-Data Estiża. Tmien linkers GS4 (f'tandem) ġew inseriti qabel it-tikketta 6xHis C-terminali tal-kostruzzjoni pET-21a(+)-EcK2. Il-proteini rikombinanti ġew prodotti bl-użu tar-reazzjoni tas-sintesi tal-proteini E. coli mingħajr ċelluli NEBExpress (New England BioLabs). Il-proteini rikombinanti ġew purifikati bl-użu tal-kolonni spin NEBExpress Ni (New England BioLabs). Il-proteina ta' kontroll tad-dihydrofolate reductase (DHFR) ġiet prodotta bl-użu ta' mudell tad-DNA mill-Kit tas-Sintesi tal-Proteini E. coli mingħajr Ċelluli NEBExpress. Il-proteini ġew maħżuna f'50% gliċerol f'PBS f'-20 °C għal massimu ta' 3 xhur.
L-attività tal-fosfatażi tal-EPP u l-estratti tat-tessuti tkejlet bl-użu ta' 4-nitrophenyl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich). Il-buffer tar-reazzjoni kien fih 25 mM Tris, 50 mM aċidu aċetiku, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, u 1 mM DTT. It-tessut ġie omoġenizzat fil-buffer tar-reazzjoni u l-fdalijiet taċ-ċelluli tneħħew permezz ta' ċentrifugazzjoni. Ibda r-reazzjoni billi żżid enzima jew estratt tat-tessut mal-buffer tar-reazzjoni li fih 2.5 mg ml-1 pNPP. It-taħlita tar-reazzjoni ġiet inkubata f'temperatura tal-kamra fid-dlam, u l-ammont ta' pNP konvertit minn pNPP ġie kwantifikat billi tkejlet l-assorbenza f'405 nm f'ħinijiet differenti.
Għall-attività EcK in vitro, il-proteina ġiet inkubata b'0.2 mg 20E jew 3D20E f'200 µl buffer (pH 7.5) li kien fih 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP u 10 mM MgCl2 għal sagħtejn f'27 °C. Ir-reazzjoni twaqqfet billi żdiedu 800 µl metanol, imbagħad tkessħet f'-20 °C għal siegħa, imbagħad ġiet ċentrifugata f'20,000 g għal 10 minuti f'4 °C. Is-supernatant imbagħad ġie analizzat permezz ta' HPLC-MS/MS. Biex il-proteini użati fil-grupp ta' kontroll jiġu inattivati ​​bis-sħana, il-proteini ġew inkubati f'50% gliċerol f'PBS għal 20 minuta f'95 °C.
Għall-attività EPP in vitro, il-proteina ġiet inkubata bi 3D20E22P (ekwivalenti għall-ammont misjub fi 18-il par ta' MAG, purifikati permezz ta' HPLC-MS/MS) f'100 µl buffer (pH 7.5) li fih 25 mM Tris, 50 mM aċidu aċetiku, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, u 1 mM DTT għal 3 sigħat f'27 °C. Ir-reazzjoni twaqqfet billi żdiedu 400 µl metanol u tkessħet f'-20 °C għal siegħa, imbagħad ġiet ċentrifugata f'20,000 g għal 10 minuti f'4 °C. Is-supernatant ġie analizzat permezz ta' HPLC-MS/MS.
Frammenti tal-PCR għal EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) u EcK2 (556 bp) ġew amplifikati minn cDNA ppreparat minn kadavri ta' nemus mingħajr ras ta' sessi mħallta. Il-framment tal-PCR tal-kontroll tal-eGFP (495 bp) ġie amplifikat mill-pCR2.1-eGFP deskritt qabel; Il-primers tal-PCR huma elenkati fit-Tabella tad-Dejta Estiża 2. Il-framment tal-PCR ġie mdaħħal bejn il-promoturi T7 maqlubin fuq il-plasmid pL4440. Il-kostruzzjonijiet tal-plasmid ġew irkuprati minn E. coli kompetenti NEB 5-α (New England Biolabs) u vverifikati permezz ta' sekwenzar tad-DNA qabel l-użu (ara d-Dejta Supplimentari 1 għas-sekwenza tal-inserzjoni). Il-primers imqabbla mal-promotur T7 (Tabella tad-Dejta Estiża 2) intużaw biex jamplifikaw l-inserzjoni mill-plasmid ibbażat fuq pL4440. Id-daqs tal-prodott tal-PCR ġie kkonfermat permezz ta' elettroforesi bil-ġel tal-agarose. Id-dsRNA ġie traskritt minn mudelli tal-PCR bl-użu tal-Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) u ppurifikat skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur bil-modifiki deskritti qabel.
Għall-injezzjoni ta' dsRNA, 1,380 ng ta' dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ġew injettati f'konċentrazzjoni ta' 10 ng nl-1 fit-toraċi ta' rġiel jew nisa adulti (Nanoject III, Drummond) fi żmien jum wara l-ekklużjoni. Il-livelli ta' tnaqqis tal-ġeni ġew determinati f'mill-inqas tliet repliki bijoloġiċi permezz ta' estrazzjoni tal-RNA, sinteżi tas-cDNA, u RT-qPCR. Għall-injezzjoni ta' ecdysone, nisa verġni ta' 4 ijiem jew verġni ta' 6 ijiem li ngħataw demm ġew injettati b'0.13, 0.21, jew 0.63 µg ta' 20E jew 3D20E (Nanoject III, Drummond) f'konċentrazzjonijiet ta' 1.3, 2.1, rispettivament, skont id-disinn sperimentali jew 6.3 ng nl-1. Injetta 100 nl ta' 10% (vol/vol) etanol fl-ilma; 100 nl ta' 3D20E22P f'10% etanol (ekwivalenti għal 75% tal-ammont misjub f'par ta' MAGs). In-nemus ġew assenjati b'mod każwali lill-grupp ta' injezzjoni.
Għall-assaġġi tat-tbid, nisa ta’ 3 ijiem ingħataw demm uman ad libitum. Neħħi n-nemus li kienu mitmugħa parzjalment jew le. Skont it-trattament, in-nisa tqiegħdu fi tazzi separati tat-tbid għal erbat iljieli mill-inqas 48 siegħa wara l-ikel bid-demm. Il-bajd ingħadd taħt sterjoskopju (Stemi 508, Zeiss); għal nisa mgħammrin, il-bajd li faqqas f’larva kien ikkunsidrat fertili.
Għall-provi tat-tgħammir, in-nisa tħallew jieħdu mill-inqas jumejn skont it-trattament biex jiżviluppaw reżistenza għat-tgħammir, u l-irġiel tat-tip selvaġġ tal-istess età ġew introdotti sussegwentement fl-istess gaġġa. Żewġ iljieli wara, il-vesikoli fertilizzati tan-nisa ġew dissezzjonati u d-DNA ġenomiku ġie rilaxxat permezz ta' friża-tidwib u sonikazzjoni f'buffer li kien fih 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, u 25 mM NaCl (pH 8.2). Il-kampjuni ġew inkubati bi Proteinase K (0.86 µg µl-1) għal 15-il minuta f'55 °C, segwiti minn 10 minuti f'95 °C. Il-preparazzjonijiet tad-DNA ġenomiku mhux raffinat ġew dilwiti 10 darbiet u soġġetti għal skoperta qPCR tas-sekwenzi tal-kromożomi Y; il-primers huma elenkati fit-Tabella 2 tad-Dejta Estiża. In-nuqqas tas-sekwenza tal-kromożomi Y jindika li ma kienx hemm tgħammir.
Għal assays ta' tgħammir mill-ġdid, in-nisa mgħammrin bil-forza ġew eżaminati għall-preżenza ta' tappijiet tat-tgħammir biex jikkonfermaw l-istatus tat-tgħammir u tħallew jumejn biex jiżviluppaw refrattorjetà għat-tgħammir fin-nuqqas ta' rġiel, kif deskritt qabel 36. L-irġiel li jġorru sperma transġenika DsRed imbagħad ġew introdotti f'gaġeġ tan-nisa. Żewġ iljieli wara, il-vesikoli fertilizzanti ġew dissezzjonati min-nisa, u d-DNA ġenomiku ġie ppreparat kif deskritt hawn fuq u ġie soġġett għal skoperta qPCR tat-transġene DsRed; il-primers huma elenkati fit-Tabella 2 tad-Data Estiża. L-assenza tat-transġene DsRed indikat li ma seħħ l-ebda tgħammir mill-ġdid.
3D20E ġie sintetizzat kif deskritt qabel 37. Fil-qosor, 10 mg ta' 20E (Sigma-Aldrich) ġew maħlula f'10 ml ilma, segwiti biż-żieda ta' 30 mg ta' platinu iswed (f'forma ta' trab, Sigma-Aldrich). Nixxiegħa ġentili ta' O2 ġiet kontinwament imdaħħla fit-taħlita ta' reazzjoni, li tħawdet f'temperatura tal-kamra. Wara 6 sigħat, ġew miżjuda 30 mL ta' metanol biex titwaqqaf ir-reazzjoni. It-taħlita ġiet ċentrifugata biex jitneħħew il-partiċelli tal-katalist. Is-supernatant ġie evaporat sakemm jinxef fil-vakwu f'temperatura tal-kamra. Il-prodott ta' reazzjoni mnixxef ġie maħlul f'10% etanol u metanol għall-injezzjoni għall-analiżi HPLC-MS/MS. Ir-rata ta' konverżjoni (minn 20E għal 3D20E) kienet ta' madwar 97% (Fig. 4b), u l-ispettru MS tat-3D20E sintetizzat qabel ma' dak li nstab f'nisa mgħammrin (Fig. 4c).
Il-leġġenda fiha dettalji speċifiċi tat-testijiet statistiċi mwettqa. GraphPad (verżjoni 9.0) intuża biex iwettaq it-test eżatt ta' Fisher, it-test Mantel-Cox, u t-test t ta' Student. It-testijiet Cochran-Mantel-Haenszel twettqu bl-użu ta' skript R apposta (disponibbli fuq https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Id-distribuzzjoni tad-dejta ġiet ittestjata għan-normalità bl-użu tat-test Shapiro-Wilk b'limitu ta' sinifikat ta' 0.05. Meta d-dejta falliet it-test tan-normalità, twettaq it-test Mann-Whitney. Id-dejta tas-sopravivenza ġiet analizzata bl-użu tat-test Mantel-Cox. Il-pakkett DESeq2 (verżjoni 1.28.1) intuża biex iwettaq analiżi tal-espressjoni differenzjali fil-livell tal-ġene RNA-seq. Il-virga orizzontali fuq il-graff tirrappreżenta l-medjan. Valur ta' sinifikat ta' P = 0.05 intuża bħala l-limitu għat-testijiet kollha.
Għal aktar informazzjoni dwar id-disinn tal-istudju, ara l-astratt tan-Nature Research Report marbut ma’ dan l-artiklu.
Id-dejta proteomika tal-MS ġiet depożitata fil-ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) permezz tal-PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) bl-identifikatur tas-sett tad-dejta PXD032157.
Is-sett tad-dejta tal-RNA-seq huwa depożitat fil-Librerija Komprensiva tal-Espressjoni tal-Ġeni (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) taħt ir-rekord tas-serje GSE198665.
Settijiet ta' dejta addizzjonali ġġenerati u/jew analizzati matul l-istudju attwali jistgħu jinkisbu mingħand l-awturi korrispondenti fuq talba raġonevoli. Dan l-artiklu jipprovdi d-dejta tas-sors.
De Loof, A. Ecdysteroids: Sterojdi sesswali tal-insetti traskurati? Raġel: Black Box. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone u l-iżvilupp tal-ovarji f'Anopheles stephens.J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).