L-aċidu propjoniku (PPA), aġent antifungali u addittiv komuni fid-dieta, intwera li jikkawża żvilupp newroloġiku anormali fil-ġrieden akkumpanjat minn disfunzjoni gastrointestinali, li tista' tkun ikkawżata minn disbjożi tal-imsaren. Ġiet issuġġerita rabta bejn l-esponiment għad-dieta għall-PPA u d-disbjożi tal-mikrobijota tal-imsaren, iżda ma ġietx investigata direttament. Hawnhekk, investigajna bidliet assoċjati mal-PPA fil-kompożizzjoni tal-mikrobijota tal-imsaren li jistgħu jwasslu għal disbjożi. Il-mikrobijomi tal-imsaren tal-ġrieden li ngħataw dieta mhux trattata (n=9) u dieta arrikkita bil-PPA (n=13) ġew sekwenzati bl-użu ta' sekwenzar metaġenomiku fuq medda twila ta' żmien biex jiġu vvalutati d-differenzi fil-kompożizzjoni mikrobjali u l-mogħdijiet metaboliċi batteriċi. Il-PPA fid-dieta kien assoċjat ma' żieda fl-abbundanza ta' taxa sinifikanti, inklużi diversi speċi ta' Bacteroides, Prevotella, u Ruminococcus, li membri tagħhom qabel kienu implikati fil-produzzjoni tal-PPA. Il-mikrobijomi tal-ġrieden esposti għall-PPA kellhom ukoll aktar mogħdijiet relatati mal-metaboliżmu tal-lipidi u l-bijosintesi tal-ormoni sterojdi. Ir-riżultati tagħna jindikaw li l-PPA jista' jbiddel il-mikrobijota tal-imsaren u l-mogħdijiet metaboliċi assoċjati tagħha. Dawn il-bidliet osservati jenfasizzaw li l-preservattivi kklassifikati bħala sikuri għall-konsum jistgħu jinfluwenzaw il-kompożizzjoni tal-mikrobijota tal-imsaren u, min-naħa tagħhom, is-saħħa tal-bniedem. Fosthom, P, G jew S jintgħażlu skont il-livell ta' klassifikazzjoni li qed jiġi analizzat. Biex jiġi minimizzat l-impatt ta' klassifikazzjonijiet foloz pożittivi, ġie adottat limitu minimu ta' abbundanza relattiva ta' 1e-4 (1/10,000 qari). Qabel l-analiżi statistika, l-abbundanzi relattivi rrappurtati minn Bracken (fraction_total_reads) ġew trasformati bl-użu tat-trasformazzjoni centered log-ratio (CLR) (Aitchison, 1982). Il-metodu CLR intgħażel għat-trasformazzjoni tad-dejta għaliex ma jvarjax fl-iskala u huwa suffiċjenti għal settijiet ta' dejta mhux sparsi (Gloor et al., 2017). It-trasformazzjoni CLR tuża l-logaritmu naturali. Id-dejta tal-għadd irrappurtata minn Bracken ġiet normalizzata bl-użu tal-espressjoni relattiva tal-logaritmu (RLE) (Anders and Huber, 2010). Iċ-ċifri ġew iġġenerati bl-użu ta' taħlita ta' matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 u logaritmi sekwenzjali (Gloor et al., 2017). 0.12.2 u stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Il-proporzjon Bacillus/Bacteroidetes ġie kkalkulat għal kull kampjun bl-użu tal-għadd ta' batterji normalizzati. Il-valuri rrappurtati fit-tabelli huma mqarrba għal 4 postijiet deċimali. L-indiċi tad-diversità ta' Simpson ġie kkalkulat bl-użu tal-iskritt alpha_diversity.py ipprovdut fil-pakkett KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). Ir-rapport Bracken huwa pprovdut fl-iskritt u l-indiċi Simpson "Si" huwa pprovdut għall-parametru -an. Differenzi sinifikanti fl-abbundanza ġew definiti bħala differenzi medji tas-CLR ≥ 1 jew ≤ -1. Differenza medja tas-CLR ta' ±1 tindika żieda ta' 2.7 darbiet fl-abbundanza ta' tip ta' kampjun. Is-sinjal (+/-) jindika jekk it-taxon huwiex aktar abbundanti fil-kampjun tal-PPA u fil-kampjun ta' kontroll, rispettivament. Is-sinifikat ġie determinat bl-użu tat-test Mann-Whitney U (Virtanen et al., 2020). Intuża Statsmodels v. 0.14 (Benjamini and Hochberg, 1995; Seabold and Perktold, 2010), u ġiet applikata l-proċedura Benjamini-Hochberg biex tikkoreġi għal ittestjar multiplu. Valur-p aġġustat ≤ 0.05 intuża bħala l-limitu biex tiġi ddeterminata s-sinifikat statistiku.
Il-mikrobijoma umana ħafna drabi tissejjaħ "l-aħħar organu tal-ġisem" u għandha rwol vitali fis-saħħa tal-bniedem (Baquero u Nombela, 2012). B'mod partikolari, il-mikrobijoma tal-imsaren hija rikonoxxuta għall-influwenza tagħha fis-sistema kollha u r-rwol tagħha f'ħafna funzjonijiet essenzjali. Il-batterji kommensali huma abbundanti fl-imsaren, jokkupaw niċeċ ekoloġiċi multipli, jużaw nutrijenti, u jikkompetu ma' patoġeni potenzjali (Jandhyala et al., 2015). Komponenti batteriċi diversi tal-mikrobijota tal-imsaren huma kapaċi jipproduċu nutrijenti essenzjali bħal vitamini u jippromwovu d-diġestjoni (Rowland et al., 2018). Il-metaboliti batteriċi ntwerew ukoll li jinfluwenzaw l-iżvilupp tat-tessuti u jtejbu l-mogħdijiet metaboliċi u immuni (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Il-kompożizzjoni tal-mikrobijoma tal-imsaren tal-bniedem hija estremament diversa u tiddependi fuq fatturi ġenetiċi u ambjentali bħad-dieta, is-sess, il-mediċini, u l-istat tas-saħħa (Kumbhare et al., 2019).
Id-dieta materna hija komponent kritiku tal-iżvilupp tal-fetu u tan-neonati u sors putattiv ta’ komposti li jistgħu jinfluwenzaw l-iżvilupp (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Kompost wieħed ta’ interess bħal dan huwa l-aċidu propjoniku (PPA), prodott sekondarju ta’ aċidu xaħmi b’katina qasira miksub mill-fermentazzjoni batterika u addittiv tal-ikel (den Besten et al., 2013). Il-PPA għandu proprjetajiet antibatteriċi u antifungali u għalhekk jintuża bħala preservattiv tal-ikel u f’applikazzjonijiet industrijali biex jinibixxi t-tkabbir tal-moffa u tal-batterja (Wemmenhove et al., 2016). Il-PPA għandu effetti differenti f’tessuti differenti. Fil-fwied, il-PPA għandu effetti anti-infjammatorji billi jaffettwa l-espressjoni taċ-ċitokini fil-makrofaġi (Kawasoe et al., 2022). Dan l-effett regolatorju ġie osservat ukoll f’ċelloli immuni oħra, li jwassal għal tnaqqis fl-infjammazzjoni (Haase et al., 2021). Madankollu, l-effett oppost ġie osservat fil-moħħ. Studji preċedenti wrew li l-esponiment għall-PPA jikkaġuna mġiba simili għall-awtiżmu fil-ġrieden (El-Ansary et al., 2012). Studji oħra wrew li l-PPA jista' jikkaġuna glijożi u jattiva mogħdijiet pro-infjammatorji fil-moħħ (Abdelli et al., 2019). Minħabba li l-PPA huwa aċidu dgħajjef, jista' jinfirex mill-epitelju intestinali fid-demm u b'hekk jaqsam ostakli restrittivi inkluż il-barriera bejn id-demm u l-moħħ kif ukoll il-plaċenta (Stinson et al., 2019), u dan jenfasizza l-importanza tal-PPA bħala metabolit regolatorju prodott mill-batterji. Għalkemm ir-rwol potenzjali tal-PPA bħala fattur ta' riskju għall-awtiżmu bħalissa qed jiġi investigat, l-effetti tiegħu fuq individwi bl-awtiżmu jistgħu jestendu lil hinn mill-induzzjoni ta' differenzjazzjoni newrali.
Sintomi gastrointestinali bħad-dijarea u l-istitikezza huma komuni f'pazjenti b'disturbi newro-żviluppali (Cao et al., 2021). Studji preċedenti wrew li l-mikrobijoma ta' pazjenti b'disturbi fl-ispettru tal-awtiżmu (ASD) hija differenti minn dik ta' individwi b'saħħithom, u dan jissuġġerixxi l-preżenza ta' disbjożi tal-mikrobijota tal-imsaren (Finegold et al., 2010). Bl-istess mod, il-karatteristiċi tal-mikrobijoma ta' pazjenti b'mard infjammatorju tal-imsaren, obeżità, marda ta' Alzheimer, eċċ. huma wkoll differenti minn dawk ta' individwi b'saħħithom (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Madankollu, sal-lum, ma ġiet stabbilita l-ebda relazzjoni kawżali bejn il-mikrobijoma tal-imsaren u mard jew sintomi newroloġiċi (Yap et al., 2021), għalkemm diversi speċi ta' batterji huma maħsuba li għandhom rwol f'xi wħud minn dawn l-istati ta' mard. Pereżempju, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio u ġeneri oħra huma aktar abbundanti fil-mikrobijota ta' pazjenti bl-awtiżmu (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Ta' min jinnota li speċi membri ta' wħud minn dawn il-ġeneri huma magħrufa li għandhom ġeni assoċjati mal-produzzjoni tal-PPA (Reichardt et al., 2014; Yun and Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur and Dürre, 2023). Minħabba l-proprjetajiet antimikrobiċi tal-PPA, iż-żieda fl-abbundanza tiegħu tista' tkun ta' benefiċċju għat-tkabbir ta' batterji li jipproduċu l-PPA (Jacobson et al., 2018). Għalhekk, ambjent rikk fil-PFA jista' jwassal għal bidliet fil-mikrobijota tal-imsaren, inklużi patoġeni gastrointestinali, li jistgħu jkunu fatturi potenzjali li jwasslu għal sintomi gastrointestinali.
Mistoqsija ċentrali fir-riċerka tal-mikrobijoma hija jekk id-differenzi fil-kompożizzjoni mikrobjali humiex kawża jew sintomu ta' mard sottostanti. L-ewwel pass biex tiġi ċċarata r-relazzjoni kumplessa bejn id-dieta, il-mikrobijoma tal-imsaren, u l-mard newroloġiku huwa li jiġu vvalutati l-effetti tad-dieta fuq il-kompożizzjoni mikrobjali. Għal dan il-għan, użajna sekwenzar metaġenomiku b'qari twil biex inqabblu l-mikrobijomi tal-imsaren tal-frieħ tal-ġrieden li ngħataw dieta rikka fil-PPA jew dieta nieqsa mill-PPA. Il-frieħ ingħataw l-istess dieta bħal ommijiethom. Aħna ipoteżizzajna li dieta rikka fil-PPA tirriżulta f'bidliet fil-kompożizzjoni mikrobjali tal-imsaren u fil-mogħdijiet funzjonali mikrobjali, partikolarment dawk relatati mal-metaboliżmu tal-PPA u/jew il-produzzjoni tal-PPA.
Dan l-istudju uża ġrieden transġeniċi FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) li jesprimu żżejjed proteina fluworexxenti ħadra (GFP) taħt il-kontroll tal-promotur GFAP speċifiku għall-glia wara l-linji gwida tal-Kumitat għall-Kura u l-Użu tal-Annimali Istituzzjonali tal-Università ta' Florida Ċentrali (UCF-IACUC) (Numru tal-Permess għall-Użu tal-Annimali: PROTO202000002). Wara l-ftim, il-ġrieden tpoġġew individwalment f'gaġeġ b'1–5 ġrieden ta' kull sess għal kull gaġġa. Il-ġrieden ingħataw l-ikel ad libitum jew b'dieta ta' kontroll purifikata (dieta standard open-label modifikata, 16 kcal% xaħam) jew b'dieta supplimentata b'sodium propionate (dieta standard open-label modifikata, 16 kcal% xaħam, li fiha 5,000 ppm sodium propionate). L-ammont ta' sodium propionate użat kien ekwivalenti għal 5,000 mg PFA/kg piż totali tal-ikel. Din hija l-ogħla konċentrazzjoni ta' PPA approvata għall-użu bħala preservattiv tal-ikel. Biex jippreparaw għal dan l-istudju, il-ġrieden ġenituri ngħataw iż-żewġ dieti għal 4 ġimgħat qabel it-tgħammir u komplew matul it-tqala tal-omm. Il-ġrieden frieħ [22 ġrieden, 9 kontroll (6 irġiel, 3 nisa) u 13 PPA (4 irġiel, 9 nisa)] tneħħew mill-fatma u mbagħad komplew bl-istess dieta bħall-ommijiet għal 5 xhur. Il-ġrieden frieħ ġew sagrifikati fl-età ta’ 5 xhur u l-kontenut fekali intestinali tagħhom inġabar u inizjalment inħażen f’tubi ta’ mikroċentrifuga ta’ 1.5 ml f’temperatura ta’ -20°C u mbagħad trasferit għal friżer ta’ -80°C sakemm id-DNA ospitanti tnaqqset u ġew estratti l-aċidi nuklejċi mikrobjali.
Id-DNA ospitanti tneħħa skont protokoll modifikat (Charalampous et al., 2019). Fil-qosor, il-kontenut fekali ġie trasferit għal 500 µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) u maħżun iffriżat. Ipproċessa massimu ta' 1-2 pritkuni fekali għal kull estrazzjoni. Il-kontenut fekali mbagħad ġie omoġenizzat mekkanikament bl-użu ta' pestle tal-plastik ġewwa t-tubu biex jifforma taħlita. Iċċentrifuga l-kampjuni b'10,000 RCF għal 5 minuti jew sakemm il-kampjuni jkunu ffurmaw pellet, imbagħad aspira s-supernatant u erġa' ssospendi l-pellet f'250 µl 1× PBS. Żid 250 µl soluzzjoni ta' 4.4% saponin (TCI, numru tal-prodott S0019) mal-kampjun bħala deterġent biex ittaffi l-membrani taċ-ċelluli ewkarjotiċi. Il-kampjuni tħalltu bil-mod sakemm ikunu lixxi u ġew inkubati f'temperatura tal-kamra għal 10 minuti. Imbagħad, biex jitkissru ċ-ċelloli ewkarjotiċi, żidna 350 μl ilma ħieles min-nukleażi mal-kampjun, inkubat għal 30 sekonda, u mbagħad żidna 12 μl 5 M NaCl. Il-kampjuni mbagħad ġew ċentrifugati f'6000 RCF għal 5 minuti. Aspira s-supernatant u erġa' ssospendi l-gerbub f'100 μl 1X PBS. Biex tneħħi d-DNA ospitanti, żid 100 μl buffer HL-SAN (12.8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml ilma ħieles min-nukleażi) u 10 μl enzima HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Il-kampjuni tħalltu sewwa billi ġew pipettati u inkubati f'temperatura ta' 37 °C għal 30 minuta b'800 rpm fuq Eppendorf™ ThermoMixer C. Wara l-inkubazzjoni, ġew iċċentrifugati b'6000 RCF għal 3 minuti u maħsula darbtejn bi 800 µl u 1000 µl 1X PBS. Fl-aħħar, il-gerbub ġie sospiż mill-ġdid f'100 µl 1X PBS.
Id-DNA batterjali totali ġie iżolat bl-użu tal-New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L). Il-proċedura operattiva standard ipprovduta mal-kit hija kemxejn modifikata. Inkuba u żomm ilma ħieles min-nukleażi f'60°C qabel l-operazzjoni għall-eluzzjoni finali. Żid 10 µl Proteinase K u 3 µl RNase A ma' kull kampjun. Imbagħad żid 100 µl Cell Lysis Buffer u ħawwad bil-mod. Il-kampjuni mbagħad ġew inkubati f'Eppendorf™ ThermoMixer C f'56°C u 1400 rpm għal mill-inqas siegħa u sa 3 sigħat. Il-kampjuni inkubati ġew ċentrifugati b'12,000 RCF għal 3 minuti u s-supernatant minn kull kampjun ġie trasferit għal tubu ta' mikroċentrifuga separat ta' 1.5 mL li fih 400 µL ta' soluzzjoni li torbot. It-tubi mbagħad ġew vortexjati bil-polz għal 5–10 sekondi f'intervalli ta' sekonda. Ittrasferixxi l-kontenut likwidu kollu ta' kull kampjun (madwar 600–700 µL) għal kartriġ tal-filtru mqiegħed f'tubu tal-ġbir li jgħaddi minnu. It-tubi ġew iċċentrifugati b'1,000 RCF għal 3 minuti biex jippermettu l-irbit inizjali tad-DNA u mbagħad iċċentrifugati b'12,000 RCF għal minuta biex jitneħħa l-likwidu residwu. Il-kolonna tal-kampjun ġiet trasferita għal tubu tal-ġbir ġdid u mbagħad maħsula darbtejn. Għall-ewwel ħasla, żid 500 µL ta' buffer tal-ħasil ma' kull tubu. Aqleb it-tubu 3–5 darbiet u mbagħad iċċentrifuga b'12,000 RCF għal minuta. Armi l-likwidu mit-tubu tal-ġbir u poġġi l-kartriġ tal-filtru lura fl-istess tubu tal-ġbir. Għat-tieni ħasla, żid 500 µL ta' buffer tal-ħasil mal-filtru mingħajr ma taqleb. Il-kampjuni ġew iċċentrifugati b'12,000 RCF għal minuta. Ittrasferixxi l-filtru għal tubu LoBind® ta' 1.5 mL u żid 100 µL ta' ilma mingħajr nukleażi msaħħan minn qabel. Il-filtri ġew inkubati f'temperatura tal-kamra għal minuta u mbagħad ċċentrifugati fi 12,000 RCF għal minuta. Id-DNA elużat inħażen f'-80°C.
Il-konċentrazzjoni tad-DNA ġiet kwantifikata bl-użu ta' Fluworometru Qubit™ 4.0. Id-DNA ġie ppreparat bl-użu tal-Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (Numru tal-Katalogu Q33231) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Id-distribuzzjoni tat-tul tal-frammenti tad-DNA ġiet imkejla bl-użu ta' Aglient™ 4150 jew 4200 TapeStation. Id-DNA ġie ppreparat bl-użu ta' Agilent™ Genomic DNA Reagents (Numru tal-Katalogu 5067-5366) u Genomic DNA ScreenTape (Numru tal-Katalogu 5067-5365). Il-preparazzjoni tal-librerija twettqet bl-użu tal-Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Id-DNA ġie sekwenzat bl-użu ta' sekwenzatur ONT GridION™ Mk1 b'ċellula tal-fluss Min106D (R 9.4.1). Is-settings tas-sekwenzar kienu: sejħa ta' bażi ta' preċiżjoni għolja, valur q minimu ta' 9, setup tal-barcode, u trim tal-barcode. Il-kampjuni ġew sekwenzati għal 72 siegħa, u wara dan id-dejta tas-sejħa bażi ġiet sottomessa għal aktar ipproċessar u analiżi.
L-ipproċessar bijoinformatiku twettaq bl-użu ta' metodi deskritti qabel (Greenman et al., 2024). Il-fajls FASTQ miksuba mis-sekwenzar ġew maqsuma f'direttorji għal kull kampjun. Qabel l-analiżi bijoinformatika, id-dejta ġiet ipproċessata bl-użu tal-pipeline li ġej: l-ewwel, il-fajls FASTQ tal-kampjuni ngħaqdu f'fajl FASTQ wieħed. Imbagħad, il-qari iqsar minn 1000 bp ġie ffiltrat bl-użu ta' Filtlong v. 0.2.1, bl-uniku parametru mibdul ikun –min_length 1000 (Wick, 2024). Qabel aktar filtrazzjoni, il-kwalità tal-qari ġiet ikkontrollata bl-użu ta' NanoPlot v. 1.41.3 bil-parametri li ġejjin: –fastq –plots dot –N50 -o
Għall-klassifikazzjoni tassonomika, il-qari u l-contigs immuntati ġew ikklassifikati bl-użu ta' Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Iġġenera rapporti u fajls tal-output għall-qari u l-assemblaġġi, rispettivament. Uża l-għażla –use-names biex tanalizza l-qari u l-assemblaġġi. L-għażliet –gzip-compressed u –paired huma speċifikati għas-segmenti tal-qari. L-abbundanza relattiva tat-taxa fil-metaġenomi ġiet stmata bl-użu ta' Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). L-ewwel ħloqna database kmer li fiha 1000 bażi bl-użu ta' bracken-build bil-parametri li ġejjin: -d
L-annotazzjoni tal-ġeni u l-istima tal-abbundanza relattiva twettqu bl-użu ta' verżjoni modifikata tal-protokoll deskritt minn Maranga et al. (Maranga et al., 2023). L-ewwel, il-contigs iqsar minn 500 bp tneħħew mill-assemblaġġi kollha bl-użu ta' SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). L-assemblaġġi magħżula mbagħad ġew ikkombinati f'pan-metagenome. L-open reading frames (ORFs) ġew identifikati bl-użu ta' Prodigal v. 1.0.1 (verżjoni parallela ta' Prodigal v. 2.6.3) bil-parametri li ġejjin: -d
Il-ġeni l-ewwel ġew miġbura skont l-identifikaturi ortologi (KO) tal-Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) assenjati minn eggNOG biex iqabblu l-abbundanzi tal-mogħdija tal-ġeni. Ġeni mingħajr knockouts jew ġeni b'knockouts multipli tneħħew qabel l-analiżi. L-abbundanza medja ta' kull KO għal kull kampjun imbagħad ġiet ikkalkulata u twettqet analiżi statistika. Il-ġeni tal-metaboliżmu tal-PPA ġew definiti bħala kwalunkwe ġene li ġie assenjat ringiela ko00640 fil-kolonna KEGG_Pathway, li tindika rwol fil-metaboliżmu tal-propjonat skont KEGG. Il-ġeni identifikati bħala assoċjati mal-produzzjoni tal-PPA huma elenkati fit-Tabella Supplimentari 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Twettqu testijiet ta' permutazzjoni biex jiġu identifikati l-ġeni tal-metaboliżmu u l-produzzjoni tal-PPA li kienu sinifikament aktar abbundanti f'kull tip ta' kampjun. Twettqu elf permutazzjoni għal kull ġene analizzat. Valur p ta' 0.05 intuża bħala limitu biex tiġi ddeterminata s-sinifikat statistiku. Annotazzjonijiet funzjonali ġew assenjati lil ġeni individwali fi ħdan raggruppament ibbażati fuq l-annotazzjonijiet ta' ġeni rappreżentattivi fi ħdan ir-raggruppament. It-taxa assoċjata mal-metaboliżmu tal-PPA u/jew il-produzzjoni tal-PPA setgħet tiġi identifikata billi jitqabblu l-IDs tal-contig fil-fajls tal-output ta' Kraken2 mal-istess IDs tal-contig miżmuma waqt l-annotazzjoni funzjonali bl-użu tal-eggNOG. L-ittestjar tas-sinifikat twettaq bl-użu tat-test Mann-Whitney U deskritt qabel. Il-korrezzjoni għal ittestjar multiplu twettqet bl-użu tal-proċedura Benjamini-Hochberg. Valur-p ta' ≤ 0.05 intuża bħala limitu biex tiġi ddeterminata s-sinifikat statistiku.
Id-diversità tal-mikrobijoma tal-imsaren tal-ġrieden ġiet ivvalutata bl-użu tal-indiċi tad-diversità ta' Simpson. Ma ġew osservati l-ebda differenzi sinifikanti bejn il-kampjuni ta' kontroll u l-PPA f'termini ta' diversità tal-ġeneru u l-ispeċi (valur p għall-ġeneru: 0.18, valur p għall-ispeċi: 0.16) (Figura 1). Il-kompożizzjoni mikrobjali mbagħad ġiet imqabbla bl-użu tal-analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA). Il-Figura 2 turi l-iggruppament tal-kampjuni skont il-phyla tagħhom, li tindika li kien hemm differenzi fil-kompożizzjoni tal-ispeċi tal-mikrobijomi bejn il-kampjuni tal-PPA u tal-kontroll. Dan l-iggruppament kien inqas evidenti fil-livell tal-ġeneru, li jissuġġerixxi li l-PPA jaffettwa ċerti batterji (Figura Supplimentari 1).
Figura 1. Diversità alfa tal-ġeneri u l-kompożizzjoni tal-ispeċi tal-mikrobijoma tal-imsaren tal-ġrieden. Plottijiet tal-kaxxa li juru l-indiċi tad-diversità ta' Simpson tal-ġeneri (A) u l-ispeċi (B) fil-kampjuni tal-PPA u tal-kontroll. Is-sinifikat ġie determinat bl-użu tat-test Mann-Whitney U, u twettqet korrezzjoni multipla bl-użu tal-proċedura Benjamini-Hochberg. ns, il-valur p ma kienx sinifikanti (p>0.05).
Figura 2. Riżultati tal-analiżi tal-komponenti prinċipali tal-kompożizzjoni tal-mikrobijoma tal-imsaren tal-ġrieden fil-livell tal-ispeċi. Il-plott tal-analiżi tal-komponenti prinċipali juri d-distribuzzjoni tal-kampjuni fl-ewwel żewġ komponenti prinċipali tagħhom. Il-kuluri jindikaw it-tip ta' kampjun: il-ġrieden esposti għall-PPA huma vjola u l-ġrieden ta' kontroll huma sofor. Il-komponenti prinċipali 1 u 2 huma pplottjati fuq l-assi x u l-assi y, rispettivament, u huma espressi bħala l-proporzjon tal-varjanza spjegata tagħhom.
Bl-użu tad-dejta tal-għadd trasformata bl-RLE, ġie osservat tnaqqis sinifikanti fil-proporzjon medjan ta' Bacteroidetes/Bacilli fil-ġrieden tal-kontroll u tal-PPA (kontroll: 9.66, PPA: 3.02; valur p = 0.0011). Din id-differenza kienet dovuta għal abbundanza ogħla ta' Bacteroidetes fil-ġrieden tal-PPA meta mqabbla mal-kontrolli, għalkemm id-differenza ma kinitx sinifikanti (medja ta' CLR tal-kontroll: 5.51, medja ta' PPA CLR: 6.62; valur p = 0.054), filwaqt li l-abbundanza ta' Bacteroidetes kienet simili (medja ta' CLR tal-kontroll: 7.76, medja ta' PPA CLR: 7.60; valur p = 0.18).
Analiżi tal-abbundanza tal-membri tassonomiċi tal-mikrobijoma tal-imsaren żvelat li filu wieħed u 77 speċi varjaw b'mod sinifikanti bejn il-kampjuni tal-PPA u dawk ta' kontroll (Tabella Supplimentari 2). L-abbundanza ta' 59 speċi fil-kampjuni tal-PPA kienet sinifikament ogħla minn dik fil-kampjuni ta' kontroll, filwaqt li l-abbundanza ta' 16-il speċi biss fil-kampjuni ta' kontroll kienet ogħla minn dik fil-kampjuni tal-PPA (Figura 3).
Figura 3. Abbundanza differenzjali ta' taxa fil-mikrobijoma tal-imsaren tal-ġrieden tal-PPA u tal-kontroll. Il-plottijiet tal-vulkan juru differenzi fl-abbundanza tal-ġeneri (A) jew l-ispeċi (B) bejn il-kampjuni tal-PPA u tal-kontroll. Tikek griżi jindikaw li m'hemm l-ebda differenza sinifikanti fl-abbundanza tat-taxa. Tikek ikkuluriti jindikaw differenzi sinifikanti fl-abbundanza (valur-p ≤ 0.05). L-aqwa 20 taxa bl-akbar differenzi fl-abbundanza bejn it-tipi ta' kampjuni huma murija bl-aħmar u blu ċar (kampjuni tal-kontroll u tal-PPA), rispettivament. Tikek sofor u vjola kienu mill-inqas 2.7 darbiet aktar abbundanti fil-kampjuni tal-kontroll jew tal-PPA milli fil-kontrolli. Tikek suwed jirrappreżentaw taxa b'abbundanzi sinifikament differenti, b'differenzi medji tas-CLR bejn -1 u 1. Il-valuri P ġew ikkalkulati bl-użu tat-test Mann-Whitney U u kkoreġuti għal ittestjar multiplu bl-użu tal-proċedura ta' Benjamini-Hochberg. Id-differenzi medji tas-CLR b'tipa grassa jindikaw differenzi sinifikanti fl-abbundanza.
Wara li analizzajna l-kompożizzjoni mikrobjali tal-imsaren, wettaqna annotazzjoni funzjonali tal-mikrobijoma. Wara li ffiltrajna l-ġeni ta’ kwalità baxxa, ġew identifikati total ta’ 378,355 ġene uniku fil-kampjuni kollha. L-abbundanza trasformata ta’ dawn il-ġeni ntużat għall-analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA), u r-riżultati wrew grad għoli ta’ raggruppament ta’ tipi ta’ kampjuni bbażati fuq il-profili funzjonali tagħhom (Figura 4).
Figura 4. Riżultati tal-PCA bl-użu tal-profil funzjonali tal-mikrobijoma tal-imsaren tal-ġrieden. Il-plott tal-PCA juri d-distribuzzjoni tal-kampjuni fl-ewwel żewġ komponenti prinċipali tagħhom. Il-kuluri jindikaw it-tip ta' kampjun: il-ġrieden esposti għall-PPA huma vjola u l-ġrieden ta' kontroll huma sofor. Il-komponenti prinċipali 1 u 2 huma pplottjati fuq l-assi x u l-assi y, rispettivament, u huma espressi bħala l-proporzjon tal-varjanza spjegat tagħhom.
Imbagħad eżaminajna l-abbundanza ta' KEGG knockouts f'tipi differenti ta' kampjuni. Ġew identifikati total ta' 3648 knockout uniku, li minnhom 196 kienu sinifikament aktar abbundanti f'kampjuni ta' kontroll u 106 kienu aktar abbundanti f'kampjuni PPA (Figura 5). Ġew skoperti total ta' 145 ġene f'kampjuni ta' kontroll u 61 ġene f'kampjuni PPA, b'abbundanzi sinifikament differenti. Il-mogħdijiet relatati mal-metaboliżmu tal-lipidi u l-aminozokkor kienu sinifikament aktar arrikkiti fil-kampjuni PPA (Tabella Supplimentari 3). Il-mogħdijiet relatati mal-metaboliżmu tan-nitroġenu u s-sistemi ta' relay tal-kubrit kienu sinifikament aktar arrikkiti fil-kampjuni ta' kontroll (Tabella Supplimentari 3). L-abbundanza ta' ġeni relatati mal-metaboliżmu tal-aminozokkor/nukleotidi (ko:K21279) u l-metaboliżmu tal-inositol fosfat (ko:K07291) kienet sinifikament ogħla fil-kampjuni PPA (Figura 5). Il-kampjuni ta' kontroll kellhom sinifikament aktar ġeni relatati mal-metaboliżmu tal-benzoat (ko:K22270), il-metaboliżmu tan-nitroġenu (ko:K00368), u l-glikoliżi/glukoneġenesi (ko:K00131) (Figura 5).
Fig. 5. Abbundanza differenzjali ta' KOs fil-mikrobijoma tal-imsaren tal-ġrieden PPA u ta' kontroll. Il-plott tal-vulkan juri d-differenzi fl-abbundanza ta' gruppi funzjonali (KOs). Tikek griżi jindikaw KOs li l-abbundanza tagħhom ma kinitx differenti b'mod sinifikanti bejn it-tipi ta' kampjuni (valur p > 0.05). Tikek ikkuluriti jindikaw differenzi sinifikanti fl-abbundanza (valur p ≤ 0.05). L-20 KO bl-akbar differenzi fl-abbundanza bejn it-tipi ta' kampjuni huma murija bl-aħmar u blu ċar, li jikkorrispondu għall-kampjuni ta' kontroll u PPA, rispettivament. Tikek sofor u vjola jindikaw KOs li kienu mill-inqas 2.7 darbiet aktar abbundanti fil-kampjuni ta' kontroll u PPA, rispettivament. Tikek suwed jindikaw KOs b'abbundanzi differenti b'mod sinifikanti, b'differenzi medji tas-CLR bejn -1 u 1. Il-valuri P ġew ikkalkulati bl-użu tat-test Mann-Whitney U u aġġustati għal paraguni multipli bl-użu tal-proċedura Benjamini-Hochberg. NaN jindika li l-KO ma jappartjenix għal mogħdija f'KEGG. Valuri medji tad-differenza tas-CLR b'tipa grassa jindikaw differenzi sinifikanti fl-abbundanza. Għal informazzjoni dettaljata dwar il-mogħdijiet li għalihom jappartjenu l-KOs elenkati, ara t-Tabella Supplimentari 3.
Fost il-ġeni annotati, 1601 ġene kellhom abbundanzi differenti b'mod sinifikanti bejn it-tipi ta' kampjuni (p ≤ 0.05), b'kull ġene jkun mill-inqas 2.7 darbiet aktar abbundanti. Minn dawn il-ġeni, 4 ġeni kienu aktar abbundanti fil-kampjuni ta' kontroll u 1597 ġene kienu aktar abbundanti fil-kampjuni tal-PPA. Minħabba li l-PPA għandu proprjetajiet antimikrobiċi, eżaminajna l-abbundanzi tal-metaboliżmu tal-PPA u l-ġeni tal-produzzjoni bejn it-tipi ta' kampjuni. Fost it-1332 ġene relatati mal-metaboliżmu tal-PPA, 27 ġene kienu aktar abbundanti b'mod sinifikanti fil-kampjuni ta' kontroll u 12-il ġene kienu aktar abbundanti fil-kampjuni tal-PPA. Fost il-223 ġene relatati mal-produzzjoni tal-PPA, ġene wieħed kien aktar abbundanti b'mod sinifikanti fil-kampjuni tal-PPA. Il-Figura 6A turi aktar l-abbundanza ogħla ta' ġeni involuti fil-metaboliżmu tal-PPA, b'abbundanza ogħla b'mod sinifikanti fil-kampjuni ta' kontroll u daqsijiet ta' effett kbar, filwaqt li l-Figura 6B tenfasizza ġeni individwali b'abbundanza ogħla b'mod sinifikanti osservata fil-kampjuni tal-PPA.
Fig. 6. Abbundanza differenzjali ta' ġeni relatati mal-PPA fil-mikrobijoma tal-imsaren tal-ġrieden. Il-plotts tal-vulkan juru d-differenzi fl-abbundanza ta' ġeni assoċjati mal-metaboliżmu tal-PPA (A) u l-produzzjoni tal-PPA (B). Tikek griżi jindikaw ġeni li l-abbundanza tagħhom ma kinitx differenti b'mod sinifikanti bejn it-tipi ta' kampjuni (valur p > 0.05). Tikek ikkuluriti jindikaw differenzi sinifikanti fl-abbundanza (valur p ≤ 0.05). L-20 ġene bl-akbar differenzi fl-abbundanza huma murija bl-aħmar u blu ċar (kampjuni ta' kontroll u PPA), rispettivament. L-abbundanza ta' tikek sofor u vjola kienet mill-inqas 2.7 darbiet akbar fil-kampjuni ta' kontroll u PPA milli fil-kampjuni ta' kontroll. Tikek suwed jirrappreżentaw ġeni b'abbundanzi differenti b'mod sinifikanti, b'differenzi medji tas-CLR bejn -1 u 1. Il-valuri P ġew ikkalkulati bl-użu tat-test Mann-Whitney U u kkoreġuti għal paraguni multipli bl-użu tal-proċedura Benjamini-Hochberg. Il-ġeni jikkorrispondu għal ġeni rappreżentattivi fil-katalgu tal-ġeni mhux żejda. L-ismijiet tal-ġeni jikkonsistu fis-simbolu KEGG li jindika ġene KO. Id-differenzi medji tas-CLR b'tipa grassa jindikaw abbundanzi differenti b'mod sinifikanti. Sing (-) jindika li m'hemm l-ebda simbolu għall-ġene fid-database KEGG.
It-taxa b'ġeni relatati mal-metaboliżmu u/jew il-produzzjoni tal-PPA ġew identifikati billi tqabblet l-identità tassonomika tal-contigs mal-ID tal-contig tal-ġene. Fil-livell tal-ġeneru, instabu 130 ġeneru li kellhom ġeni relatati mal-metaboliżmu tal-PPA u 61 ġeneru nstabu li kellhom ġeni relatati mal-produzzjoni tal-PPA (Tabella Supplimentari 4). Madankollu, l-ebda ġeneru ma wera differenzi sinifikanti fl-abbundanza (p > 0.05).
Fil-livell tal-ispeċi, instabu 144 speċi batterjali li għandhom ġeni assoċjati mal-metaboliżmu tal-PPA u 68 speċi batterjali nstabu li għandhom ġeni assoċjati mal-produzzjoni tal-PPA (Tabella Supplimentari 5). Fost il-metabolizzaturi tal-PPA, tmien batterji wrew żidiet sinifikanti fl-abbundanza bejn it-tipi ta' kampjuni, u kollha wrew bidliet sinifikanti fl-effett (Tabella Supplimentari 6). Il-metabolizzaturi kollha identifikati tal-PPA b'differenzi sinifikanti fl-abbundanza kienu aktar abbundanti fil-kampjuni tal-PPA. Il-klassifikazzjoni fil-livell tal-ispeċi żvelat rappreżentanti ta' ġeneri li ma kinux differenti b'mod sinifikanti bejn it-tipi ta' kampjuni, inklużi diversi speċi ta' Bacteroides u Ruminococcus, kif ukoll Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus, u Alcaligenes polymorpha. Fost il-batterji li jipproduċu l-PPA, erba' batterji wrew differenzi sinifikanti fl-abbundanza bejn it-tipi ta' kampjuni. L-ispeċi b'differenzi sinifikanti fl-abbundanza kienu jinkludu Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis, u Ruminococcus bovis.
F'dan l-istudju, eżaminajna l-effetti tal-espożizzjoni għall-PPA fuq il-mikrobijota tal-imsaren tal-ġrieden. Il-PPA jista' jipprovoka reazzjonijiet differenti fil-batterji għaliex huwa prodott minn ċerti speċi, użat bħala sors ta' ikel minn speċi oħra, jew għandu effetti antimikrobiċi. Għalhekk, iż-żieda tiegħu mal-ambjent tal-imsaren permezz ta' supplimentazzjoni tad-dieta jista' jkollha effetti differenti skont it-tolleranza, is-suxxettibilità, u l-abbiltà li jintuża bħala sors ta' nutrijenti. Speċi batteriċi sensittivi jistgħu jiġu eliminati u sostitwiti b'dawk li huma aktar reżistenti għall-PPA jew kapaċi jużawh bħala sors ta' ikel, u dan iwassal għal bidliet fil-kompożizzjoni tal-mikrobijota tal-imsaren. Ir-riżultati tagħna żvelaw differenzi sinifikanti fil-kompożizzjoni mikrobjali iżda l-ebda effett fuq id-diversità mikrobjali ġenerali. L-akbar effetti ġew osservati fil-livell tal-ispeċi, b'aktar minn 70 taxa differenti b'mod sinifikanti fl-abbundanza bejn il-kampjuni tal-PPA u tal-kontroll (Tabella Supplimentari 2). Evalwazzjoni ulterjuri tal-kompożizzjoni tal-kampjuni esposti għall-PPA żvelat eteroġeneità akbar tal-ispeċi mikrobjali meta mqabbla mal-kampjuni mhux esposti, li tissuġġerixxi li l-PPA jista' jtejjeb il-karatteristiċi tat-tkabbir batterjali u jillimita l-popolazzjonijiet batterjali li jistgħu jgħixu f'ambjenti rikki fil-PPA. Għalhekk, il-PPA jista' b'mod selettiv jikkaġuna bidliet aktar milli jikkawża tfixkil mifrux fid-diversità tal-mikrobijota tal-imsaren.
Preservattivi tal-ikel bħall-PPA ntwerew qabel li jbiddlu l-abbundanza tal-komponenti tal-mikrobijoma tal-imsaren mingħajr ma jaffettwaw id-diversità ġenerali (Nagpal et al., 2021). Hawnhekk, osservajna l-aktar differenzi impressjonanti bejn l-ispeċi Bacteroidetes fil-phylum Bacteroidetes (magħrufa qabel bħala Bacteroidetes), li kienu arrikkiti b'mod sinifikanti fil-ġrieden esposti għall-PPA. Abbundanza akbar ta' speċi Bacteroides hija assoċjata ma' degradazzjoni akbar tal-mukus, li tista' żżid ir-riskju ta' infezzjoni u tippromwovi l-infjammazzjoni (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Studju wieħed sab li ġrieden irġiel tat-twelid ittrattati b'Bacteroides fragilis urew imġieba soċjali li tfakkar fid-disturb tal-ispettru tal-awtiżmu (ASD) (Carmel et al., 2023), u studji oħra wrew li l-ispeċi Bacteroides jistgħu jbiddlu l-attività immuni u jwasslu għal kardjomijopatija infjammatorja awtoimmuni (Gil-Cruz et al., 2019). L-ispeċi li jappartjenu għall-ġeneri Ruminococcus, Prevotella, u Parabacteroides żdiedu wkoll b'mod sinifikanti fil-ġrieden esposti għall-PPA (Coretti et al., 2018). Ċerti speċi ta' Ruminococcus huma assoċjati ma' mard bħall-marda ta' Crohn permezz tal-produzzjoni ta' ċitokini proinfjammatorji (Henke et al., 2019), filwaqt li l-ispeċi ta' Prevotella bħal Prevotella humani huma assoċjati ma' mard metaboliku bħall-ipertensjoni u s-sensittività għall-insulina (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Fl-aħħar nett, sibna li l-proporzjon ta' Bacteroidetes (magħrufa qabel bħala Firmicutes) għal Bacteroidetes kien sinifikament aktar baxx fil-ġrieden esposti għall-PPA milli fil-ġrieden ta' kontroll minħabba abbundanza totali ogħla ta' speċi ta' Bacteroidetes. Dan il-proporzjon intwera qabel li huwa indikatur importanti tal-omeostażi intestinali, u disturbi f'dan il-proporzjon ġew assoċjati ma' diversi stati ta' mard (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), inkluż mard infjammatorju tal-musrana (Stojanov et al., 2020). Kollettivament, l-ispeċi tal-filu Bacteroidetes jidhru li huma l-aktar affettwati minn PPA elevat fid-dieta. Dan jista' jkun minħabba tolleranza ogħla għall-PPA jew il-kapaċità li jintuża l-PPA bħala sors ta' enerġija, li ntwera li huwa minnu għal mill-inqas speċi waħda, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Alternattivament, l-esponiment matern għall-PPA jista' jtejjeb l-iżvilupp tal-fetu billi jagħmel l-imsaren tal-frieħ tal-ġrieden aktar suxxettibbli għall-kolonizzazzjoni tal-Bacteroidetes; madankollu, id-disinn tal-istudju tagħna ma ppermettiex tali valutazzjoni.
Il-valutazzjoni tal-kontenut metaġenomiku żvelat differenzi sinifikanti fl-abbundanza ta' ġeni assoċjati mal-metaboliżmu u l-produzzjoni tal-PPA, bil-ġrieden esposti għall-PPA juru abbundanza ogħla ta' ġeni responsabbli għall-produzzjoni tal-PPA, filwaqt li ġrieden mhux esposti għall-PPA juru abbundanza ogħla ta' ġeni responsabbli għall-metaboliżmu tal-PAA (Figura 6). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-effett tal-PPA fuq il-kompożizzjoni mikrobjali jista' ma jkunx biss minħabba l-użu tiegħu, inkella l-abbundanza ta' ġeni assoċjati mal-metaboliżmu tal-PPA kellha turi abbundanza ogħla fil-mikrobijoma tal-imsaren tal-ġrieden esposti għall-PPA. Spjegazzjoni waħda hija li l-PPA jimmedja l-abbundanza batterjali primarjament permezz tal-effetti antimikrobiċi tiegħu aktar milli permezz tal-użu tiegħu mill-batterji bħala nutrijent. Studji preċedenti wrew li l-PPA jinibixxi t-tkabbir tas-Salmonella Typhimurium b'mod dipendenti mid-doża (Jacobson et al., 2018). L-esponiment għal konċentrazzjonijiet ogħla ta' PPA jista' jagħżel batterji li huma reżistenti għall-proprjetajiet antimikrobiċi tiegħu u jistgħu mhux neċessarjament ikunu jistgħu jimmetabolizzawh jew jipproduċuh. Pereżempju, diversi speċi ta' Parabacteroides urew abbundanza ferm ogħla fil-kampjuni tal-PPA, iżda ma ġew osservati l-ebda ġeni relatati mal-metaboliżmu jew il-produzzjoni tal-PPA (Tabelli Supplimentari 2, 4, u 5). Barra minn hekk, il-produzzjoni tal-PPA bħala prodott sekondarju tal-fermentazzjoni hija mqassma b'mod wiesa' fost diversi batterji (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Diversità batterika ogħla tista' tkun ir-raġuni għall-abbundanza ogħla ta' ġeni relatati mal-metaboliżmu tal-PPA fil-kampjuni ta' kontroll (Averina et al., 2020). Barra minn hekk, 27 biss (2.14%) minn 1332 ġene kienu mbassra li huma ġeni assoċjati esklussivament mal-metaboliżmu tal-PPA. Ħafna ġeni assoċjati mal-metaboliżmu tal-PPA huma involuti wkoll f'mogħdijiet metaboliċi oħra. Dan juri aktar li l-abbundanza ta' ġeni involuti fil-metaboliżmu tal-PPA kienet ogħla fil-kampjuni ta' kontroll; dawn il-ġeni jistgħu jiffunzjonaw f'mogħdijiet li ma jirriżultawx fl-użu jew il-formazzjoni tal-PPA bħala prodott sekondarju. F'dan il-każ, ġene wieħed biss assoċjat mal-ġenerazzjoni tal-PPA wera differenzi sinifikanti fl-abbundanza bejn it-tipi ta' kampjuni. B'kuntrast mal-ġeni assoċjati mal-metaboliżmu tal-PPA, intgħażlu ġeni markaturi għall-produzzjoni tal-PPA għaliex huma involuti direttament fil-mogħdija batterjali għall-produzzjoni tal-PPA. Fil-ġrieden esposti għall-PPA, l-ispeċi kollha nstabu li kellhom abbundanza u kapaċità miżjuda b'mod sinifikanti biex jipproduċu PPA. Dan jappoġġja t-tbassir li l-PPAs jagħżlu produtturi tal-PPA u għalhekk ibassru li l-kapaċità tal-produzzjoni tal-PPA tiżdied. Madankollu, l-abbundanza tal-ġeni mhux neċessarjament tikkorrelata mal-espressjoni tal-ġeni; għalhekk, għalkemm l-abbundanza ta' ġeni assoċjati mal-metaboliżmu tal-PPA hija ogħla fil-kampjuni ta' kontroll, ir-rata ta' espressjoni tista' tkun differenti (Shi et al., 2014). Biex tiġi kkonfermata r-relazzjoni bejn il-prevalenza ta' ġeni li jipproduċu l-PPA u l-produzzjoni tal-PPA, huma meħtieġa studji dwar l-espressjoni tal-ġeni involuti fil-produzzjoni tal-PPA.
L-annotazzjoni funzjonali tal-PPA u l-metaġenomi ta' kontroll żvelat xi differenzi. L-analiżi PCA tal-kontenut tal-ġeni żvelat raggruppamenti diskreti bejn il-kampjuni tal-PPA u tal-kontroll (Figura 5). Ir-raggruppament fi ħdan il-kampjun żvela li l-kontenut tal-ġeni ta' kontroll kien aktar divers, filwaqt li l-kampjuni tal-PPA ġew miġbura flimkien. Ir-raggruppament skont il-kontenut tal-ġeni kien komparabbli mar-raggruppament skont il-kompożizzjoni tal-ispeċi. Għalhekk, id-differenzi fl-abbundanza tal-mogħdijiet huma konsistenti mal-bidliet fl-abbundanza ta' speċi u razez speċifiċi fi ħdanhom. Fil-kampjuni tal-PPA, żewġ mogħdijiet b'abbundanza sinifikament ogħla kienu relatati mal-metaboliżmu taz-zokkor amino/nukleotide (ko:K21279) u mogħdijiet multipli tal-metaboliżmu tal-lipidi (ko:K00647, ko:K03801; Tabella Supplimentari 3). Il-ġeni assoċjati ma' ko:K21279 huma magħrufa li huma assoċjati mal-ġeneru Bacteroides, wieħed mill-ġeneri b'numru sinifikament ogħla ta' speċi fil-kampjuni tal-PPA. Din l-enzima tista' tevadi r-rispons immuni billi tesprimi polisakkaridi kapsulari (Wang et al., 2008). Dan jista' jispjega ż-żieda fil-Bacteroidetes osservata fil-ġrieden esposti għall-PPA. Dan jikkumplimenta ż-żieda fis-sintesi tal-aċidi grassi osservata fil-mikrobijoma tal-PPA. Il-batterji jużaw il-mogħdija FASIIko:K00647 (fabB) biex jipproduċu aċidi grassi, li jistgħu jinfluwenzaw il-mogħdijiet metaboliċi tal-ospitant (Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020), u l-bidliet fil-metaboliżmu tal-lipidi jistgħu jkollhom rwol fl-iżvilupp newroloġiku (Yu et al., 2020). Mogħdija oħra li turi żieda fl-abbundanza fil-kampjuni tal-PPA kienet il-bijosintesi tal-ormoni sterojdi (ko:K12343). Hemm evidenza dejjem tikber li hemm relazzjoni inversa bejn il-kapaċità tal-mikrobijota tal-imsaren li tinfluwenza l-livelli tal-ormoni u li tiġi influwenzata mill-ormoni, b'tali mod li livelli elevati ta' sterojdi jista' jkollhom konsegwenzi fuq is-saħħa 'l isfel (Tetel et al., 2018).
Dan l-istudju mhuwiex mingħajr limitazzjonijiet u kunsiderazzjonijiet. Distinzjoni importanti hija li ma wettaqniex valutazzjonijiet fiżjoloġiċi tal-annimali. Għalhekk, mhux possibbli li wieħed jikkonkludi direttament jekk il-bidliet fil-mikrobijoma humiex assoċjati ma' xi marda. Konsiderazzjoni oħra hija li l-ġrieden f'dan l-istudju ngħataw l-istess dieta bħal ommijiethom. Studji futuri jistgħu jiddeterminaw jekk il-bidla minn dieta rikka fil-PPA għal dieta ħielsa mill-PPA ttejjibx l-effetti tagħha fuq il-mikrobijoma. Limitazzjoni waħda tal-istudju tagħna, bħal ħafna oħrajn, hija d-daqs limitat tal-kampjun. Għalkemm jistgħu jittieħdu konklużjonijiet validi, daqs akbar tal-kampjun jipprovdi qawwa statistika akbar meta jiġu analizzati r-riżultati. Aħna wkoll kawti dwar li naslu għal konklużjonijiet dwar assoċjazzjoni bejn bidliet fil-mikrobijoma tal-imsaren u kwalunkwe marda (Yap et al., 2021). Fatturi konfużi inklużi l-età, is-sess, u d-dieta jistgħu jinfluwenzaw b'mod sinifikanti l-kompożizzjoni tal-mikroorganiżmi. Dawn il-fatturi jistgħu jispjegaw l-inkonsistenzi osservati fil-letteratura rigward l-assoċjazzjoni tal-mikrobijoma tal-imsaren ma' mard kumpless (Johnson et al., 2019; Lagod u Naser, 2023). Pereżempju, membri tal-ġeneru Bacteroidetes intwerew li huma jew miżjuda jew imnaqqsa fl-annimali u l-bnedmin b'ASD (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Bl-istess mod, studji dwar il-kompożizzjoni tal-imsaren f'pazjenti b'mard infjammatorju tal-musrana sabu kemm żidiet kif ukoll tnaqqis fl-istess taxa (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Biex nillimitaw l-impatt tal-preġudizzju bejn is-sessi, ippruvajna niżguraw rappreżentazzjoni ugwali tas-sessi sabiex id-differenzi x'aktarx kienu mmexxija mid-dieta. Sfida waħda tal-annotazzjoni funzjonali hija t-tneħħija ta' sekwenzi ta' ġeni żejda. Il-metodu tagħna ta' raggruppament tal-ġeni jeħtieġ 95% identità tas-sekwenza u 85% similarità fit-tul, kif ukoll 90% kopertura ta' allinjament biex jiġi eliminat raggruppament falz. Madankollu, f'xi każijiet, osservajna COGs bl-istess annotazzjonijiet (eż., MUT) (Fig. 6). Huma meħtieġa aktar studji biex jiġi determinat jekk dawn l-ortologi humiex distinti, assoċjati ma' ġeneri speċifiċi, jew jekk din hijiex limitazzjoni tal-approċċ ta' raggruppament tal-ġeni. Limitazzjoni oħra tal-annotazzjoni funzjonali hija l-klassifikazzjoni ħażina potenzjali; il-ġene batterjali mmdA huwa enzima magħrufa involuta fis-sintesi tal-propjonat, iżda KEGG ma jassoċjahx mal-mogħdija metabolika tal-propjonat. B'kuntrast, l-ortologi scpB u mmcD huma relatati. L-għadd kbir ta' ġeni mingħajr knockouts magħżula jista' jirriżulta f'inkapaċità li jiġu identifikati ġeni relatati mal-PPA meta tiġi vvalutata l-abbundanza tal-ġeni. Studji futuri se jibbenefikaw mill-analiżi tal-metatraskrittoma, li tista' tipprovdi fehim aktar profond tal-karatteristiċi funzjonali tal-mikrobijota tal-imsaren u torbot l-espressjoni tal-ġeni ma' effetti potenzjali downstream. Għal studji li jinvolvu disturbi newrożviluppattivi speċifiċi jew mard infjammatorju tal-imsaren, huma meħtieġa valutazzjonijiet fiżjoloġiċi u ta' mġiba tal-annimali biex jintrabtu l-bidliet fil-kompożizzjoni tal-mikrobijoma ma' dawn id-disturbi. Studji addizzjonali li trapjantaw il-mikrobijoma tal-imsaren f'ġrieden ħielsa mill-mikrobi jkunu wkoll utli biex jiġi determinat jekk il-mikrobijoma huwiex mutur jew karatteristika tal-marda.
Fil-qosor, wrejna li l-PPA tad-dieta jaġixxi bħala fattur li jbiddel il-kompożizzjoni tal-mikrobijota tal-imsaren. Il-PPA huwa preservattiv approvat mill-FDA li jinstab ħafna f'diversi ikel li, wara espożizzjoni fit-tul, jista' jwassal għal tfixkil tal-flora normali tal-imsaren. Sibna bidliet fl-abbundanza ta' diversi batterji, li jissuġġerixxu li l-PPA jista' jinfluwenza l-kompożizzjoni tal-mikrobijota tal-imsaren. Bidliet fil-mikrobijota jistgħu jwasslu għal bidliet fil-livelli ta' ċerti mogħdijiet metaboliċi, li jistgħu jwasslu għal bidliet fiżjoloġiċi li huma rilevanti għas-saħħa tal-ospitant. Huma meħtieġa aktar studji biex jiġi determinat jekk l-effetti tal-PPA tad-dieta fuq il-kompożizzjoni mikrobjali jistgħux iwasslu għal disbjożi jew mard ieħor. Dan l-istudju jistabbilixxi l-pedamenti għal studji futuri dwar kif l-effetti tal-PPA fuq il-kompożizzjoni tal-imsaren jistgħu jkollhom impatt fuq is-saħħa tal-bniedem.
Is-settijiet tad-dejta ppreżentati f'dan l-istudju huma disponibbli f'repożitorji online. L-isem tar-repożitorju u n-numru tal-aċċessjoni huma: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Dan l-istudju fuq l-annimali ġie approvat mill-Kumitat għall-Kura u l-Użu tal-Annimali Istituzzjonali tal-Università ta' Florida Ċentrali (UCF-IACUC) (Numru tal-Permess għall-Użu tal-Annimali: PROTO202000002). Dan l-istudju jikkonforma mal-liġijiet, ir-regolamenti u r-rekwiżiti istituzzjonali lokali.
NG: Kunċettalizzazzjoni, Kurazzjoni tad-dejta, Analiżi formali, Investigazzjoni, Metodoloġija, Softwer, Viżwalizzazzjoni, Kitba (abbozz oriġinali), Kitba (reviżjoni u editjar). LA: Kunċettalizzazzjoni, Kurazzjoni tad-dejta, Metodoloġija, Riżorsi, Kitba (reviżjoni u editjar). SH: Analiżi formali, Softwer, Kitba (reviżjoni u editjar). SA: Investigazzjoni, Kitba (reviżjoni u editjar). Imħallef Kap: Investigazzjoni, Kitba (reviżjoni u editjar). SN: Kunċettalizzazzjoni, Amministrazzjoni tal-proġett, Riżorsi, Superviżjoni, Kitba (reviżjoni u editjar). TA: Kunċettalizzazzjoni, Amministrazzjoni tal-proġett, Superviżjoni, Kitba (reviżjoni u editjar).
L-awturi ddikjaraw li ma rċevew l-ebda appoġġ finanzjarju għar-riċerka, il-kitba, u/jew il-pubblikazzjoni ta’ dan l-artiklu.
L-awturi jiddikjaraw li r-riċerka twettqet fin-nuqqas ta' kwalunkwe relazzjoni kummerċjali jew finanzjarja li tista' tiġi interpretata bħala kunflitt ta' interess potenzjali. Mhux applikabbli.
L-opinjonijiet kollha espressi f'dan l-artiklu huma biss dawk tal-awturi u mhux neċessarjament jirriflettu l-fehmiet tal-istituzzjonijiet, pubblikaturi, edituri jew reviżuri tagħhom. Kwalunkwe prodott evalwat f'dan l-artiklu, jew kwalunkwe dikjarazzjoni magħmula mill-manifatturi tagħhom, mhumiex garantiti jew approvati mill-pubblikatur.
Materjal supplimentari għal dan l-artiklu jista' jinstab online: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). L-aċidu propjoniku jikkaġuna glijożi u newroinfjammazzjoni billi jirregola l-mogħdija PTEN/AKT f'disturbi tal-ispettru tal-awtiżmu. Rapporti xjentifiċi 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Analiżi statistika tad-dejta kompożizzjonali. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Il-proporzjon Firmicutes/Bacteroidetes bħala fattur ta' riskju għall-kanċer tas-sider. Ġurnal tal-Mediċina Klinika, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Analiżi differenzjali tal-espressjoni tad-dejta tal-għadd tas-sekwenzi. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, et al. (2013). Mikrobijota fekali u l-metaboloma fit-tfal bl-awtiżmu u disturb pervasiv fl-iżvilupp mhux speċifikat mod ieħor. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Karatteristiċi newrometaboliċi batteriċi tal-mikrobijota intestinali fi tfal żgħar b'disturbi tal-ispettru tal-awtiżmu. Ġurnal tal-Mikrobijoloġija Medika 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Il-mikrobijoma bħala organu uman. Mikrobijoloġija Klinika u Infezzjoni 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Għarfien ġdid dwar il-fiżjoloġija tal-batterji li jipproduċu l-aċidu propjoniku: Anaerotignum propionicum u Anaerotignum neopropionicum (li qabel kienu Clostridium propionicum u Clostridium neopropionicum). Mikroorganiżmi 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Nutrizzjoni materna u żvilupp tal-fetu. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., u Hochberg, J. (1995). Il-kontroll tar-rata ta' riżultati foloz-pożittivi: Approċċ prattiku u effiċjenti għall-ittestjar multiplu. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Ħin tal-posta: 18 ta' April 2025