Il-metaboliti immunomodulatorji huma karatteristika ewlenija tal-mikroambjent tat-tumur (TME), iżda bi ftit eċċezzjonijiet, l-identitajiet tagħhom jibqgħu fil-biċċa l-kbira mhux magħrufa. Hawnhekk, analizzajna tumuri u ċelluli T mit-tumuri u l-axxite ta' pazjenti b'karċinoma seruża ta' grad għoli (HGSC) biex niżvelaw il-metaboloma ta' dawn il-kompartimenti differenti tat-TME. L-axxite u ċ-ċelluli tat-tumur għandhom differenzi estensivi fil-metaboliti. Meta mqabbla mal-axxite, iċ-ċelluli T li jinfiltraw it-tumur huma arrikkiti b'mod sinifikanti f'1-metilnikotinamide (MNA). Għalkemm il-livell ta' MNA fiċ-ċelluli T huwa elevat, l-espressjoni ta' nikotinamide N-metiltransferażi (enzima li tikkatalizza t-trasferiment ta' gruppi metiliċi minn S-adenosilmetionina għal nikotinamide) hija limitata għal fibroblasti u ċelluli tat-tumur. Funzjonalment, l-MNA jinduċi ċ-ċelluli T biex inixxu ċ-ċitokina li tippromwovi t-tumur fattur tan-nekrożi tat-tumur alfa. Għalhekk, l-MNA derivat mit-TME jikkontribwixxi għar-regolazzjoni immuni taċ-ċelluli T u jirrappreżenta mira potenzjali ta' immunoterapija għat-trattament tal-kanċer uman.
Metaboliti derivati ​​mit-tumur jista' jkollhom effett inibitorju profond fuq l-immunità kontra t-tumur, u aktar u aktar evidenza turi li jistgħu jservu wkoll bħala forza ewlenija li tmexxi l-progressjoni tal-marda (1). Minbarra l-effett Warburg, xogħol reċenti beda jikkaratterizza l-istat metaboliku taċ-ċelloli tat-tumur u r-relazzjoni tiegħu mal-istat immuni tal-mikroambjent tat-tumur (TME). Studji fuq mudelli tal-ġrieden u ċelloli T umani wrew li l-metaboliżmu tal-glutamina (2), il-metaboliżmu ossidattiv (3) u l-metaboliżmu tal-glukożju (4) jistgħu jaġixxu b'mod indipendenti fuq diversi sottogruppi ta' ċelloli immuni. Diversi metaboliti f'dawn il-mogħdijiet jinibixxu l-funzjoni kontra t-tumur taċ-ċelloli T. Ġie ppruvat li l-imblokk tal-koenzima tetrahydrobiopterin (BH4) jista' jagħmel ħsara lill-proliferazzjoni taċ-ċelloli T, u ż-żieda ta' BH4 fil-ġisem tista' ssaħħaħ ir-rispons immuni kontra t-tumur medjat minn CD4 u CD8. Barra minn hekk, l-effett immunosoppressiv ta' kynurenine jista' jiġi salvat bl-għoti ta' BH4 (5). Fil-glioblastoma mutanti tal-isocitrate dehydrogenase (IDH), is-sekrezzjoni ta' enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) tinibixxi l-attivazzjoni, il-proliferazzjoni u l-attività taċ-ċelluli T (6). Riċentement, intwera li l-methylglyoxal, prodott sekondarju tal-glikolisi, huwa prodott minn ċelluli suppressuri ta' oriġini mijelojde, u t-trasferiment taċ-ċelluli T ta' methylglyoxal jista' jinibixxi l-funzjoni taċ-ċelluli effetturi T. Fit-trattament, in-newtralizzazzjoni tal-methylglyoxal tista' tegħleb l-attività taċ-ċelluli suppressuri derivati ​​mill-mijelojde (MDSC) u ttejjeb sinerġistikament it-terapija tal-imblokk tal-punti ta' kontroll fil-mudelli tal-ġrieden (7). Dawn l-istudji jenfasizzaw kollettivament ir-rwol ewlieni tal-metaboliti derivati ​​mit-TME fir-regolazzjoni tal-funzjoni u l-attività taċ-ċelluli T.
Disfunzjoni taċ-ċelluli T ġiet irrappurtata b'mod wiesa' fil-kanċer tal-ovarji (8). Dan huwa parzjalment dovut għall-karatteristiċi metaboliċi inerenti fl-ipoksja u l-vaskulatura anormali tat-tumur (9), li tirriżulta fil-konverżjoni tal-glukożju u t-triptofan fi prodotti sekondarji bħall-aċidu lattiku u l-kynurenine. Lattate extraċellulari eċċessiv inaqqas il-produzzjoni ta' interferon-γ (IFN-γ) u jmexxi d-differenzjazzjoni ta' sottogruppi mijelosoppressivi (10, 11). Il-konsum tat-triptofan jinibixxi direttament il-proliferazzjoni taċ-ċelluli T u jinibixxi s-sinjalar tar-riċetturi taċ-ċelluli T (12-14). Minkejja dawn l-osservazzjonijiet, ħafna xogħol dwar il-metaboliżmu immuni twettaq fil-kultura taċ-ċelluli T in vitro bl-użu ta' mezzi ottimizzati, jew limitati għal mudelli omologi tal-ġrieden in vivo, li l-ebda wieħed minnhom ma jirrifletti bis-sħiħ l-eteroġeneità tal-kanċers umani u l-ambjent makro u mikro fiżjoloġiku.
Karatteristika komuni tal-kanċer tal-ovarji hija t-tixrid peritoneali u d-dehra ta' axxite. L-akkumulazzjoni ta' fluwidu taċ-ċelluli fl-axxite hija assoċjata ma' marda avvanzata u pronjosi ħażina (15). Skont rapporti, dan il-kompartiment uniku huwa ipossiku, għandu livelli għoljin ta' fattur tat-tkabbir endoteljali vaskulari (VEGF) u indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), u huwa infiltrat minn ċelluli T regolatorji u ċelluli inibitorji majelojdi (15-18). L-ambjent metaboliku tal-axxite jista' jkun differenti minn dak tat-tumur innifsu, għalhekk ir-riprogrammazzjoni taċ-ċelluli T fl-ispazju peritoneali mhix ċara. Barra minn hekk, id-differenzi ewlenin u l-eteroġeneità bejn l-axxite u l-metaboliti preżenti fl-ambjent tat-tumur jistgħu jfixklu l-infiltrazzjoni taċ-ċelluli immuni u l-funzjoni tagħhom fuq it-tumuri, u hija meħtieġa aktar riċerka.
Sabiex insolvu dawn il-problemi, iddisinjajna metodu sensittiv ta' separazzjoni taċ-ċelloli u spettrometrija tal-massa tandem ta' kromatografija likwida (LC-MS/MS) biex nistudjaw tipi differenti ta' ċelloli (inklużi ċelloli T CD4+ u CD8+) kif ukoll fi ħdan u bejn it-tumuri. Il-metaboliti tiegħu jkopru ċelloli fl-istess ambjent ta' axxite u tumur tal-pazjent. Aħna nużaw dan il-metodu flimkien ma' ċitometrija tal-fluss b'dimensjoni għolja u sekwenzar tal-RNA ta' ċellula waħda (scRNA-seq) biex nipprovdu ritratt b'riżoluzzjoni għolja tal-istatus metaboliku ta' dawn il-popolazzjonijiet ewlenin. Dan il-metodu żvela żieda sinifikanti fil-livell ta' 1-metilnikotinamide (MNA) fiċ-ċelloli T tat-tumur, u esperimenti in vitro wrew li l-effett immunomodulatorju tal-MNA fuq il-funzjoni taċ-ċelloli T ma kienx magħruf qabel. B'mod ġenerali, dan il-metodu jiżvela l-interazzjonijiet metaboliċi reċiproċi bejn it-tumuri u ċ-ċelloli immuni, u jipprovdi għarfien uniku dwar il-metaboliti tar-regolazzjoni immuni, li jistgħu jkunu utli għat-trattament ta' immunoterapija tal-kanċer tal-ovarji bbażata fuq iċ-ċelloli T. Opportunitajiet ta' trattament.
Użajna ċitometrija tal-fluss b'dimensjonijiet għoljin biex nikkalkulaw simultanjament l-assorbiment tal-glukożju [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) u l-attività mitokondrijali [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) huma markaturi tipiċi ħdejn xulxin li jiddistingwu ċ-ċelloli immuni u l-popolazzjonijiet taċ-ċelloli tat-tumur (Tabella S2 u Figura S1A). Din l-analiżi wriet li meta mqabbla maċ-ċelloli T, l-axxite u ċ-ċelloli tat-tumur għandhom livelli ogħla ta' assorbiment tal-glukożju, iżda għandhom differenzi iżgħar fl-attività mitokondrijali. L-assorbiment medju tal-glukożju miċ-ċelloli tat-tumur [CD45-EpCAM (EpCAM)+] huwa minn tlieta sa erba' darbiet dak taċ-ċelloli T, u l-assorbiment medju tal-glukożju miċ-ċelloli CD4+ T huwa 1.2 darbiet dak taċ-ċelloli CD8+ T, li jindika li l-limfoċiti li jinfiltraw it-tumur (TIL) għandhom rekwiżiti metaboliċi differenti anke fl-istess TME (Figura 1A). B'kuntrast, l-attività mitokondrijali fiċ-ċelloli tat-tumur hija simili għal dik taċ-ċelloli T CD4+, u l-attività mitokondrijali taż-żewġ tipi ta' ċelloli hija ogħla minn dik taċ-ċelloli T CD8+ (Figura 1B). B'mod ġenerali, dawn ir-riżultati juru l-livell metaboliku. L-attività metabolika taċ-ċelloli tat-tumur hija ogħla minn dik taċ-ċelloli T CD4+, u l-attività metabolika taċ-ċelloli T CD4+ hija ogħla minn dik taċ-ċelloli T CD8+. Minkejja dawn l-effetti fit-tipi ta' ċelloli, m'hemm l-ebda differenza konsistenti fl-istatus metaboliku taċ-ċelloli T CD4+ u CD8+ jew fil-proporzjonijiet relattivi tagħhom fl-axxite meta mqabbla mat-tumuri (Figura 1C). B'kuntrast, fil-frazzjoni taċ-ċelloli CD45, il-proporzjon taċ-ċelloli EpCAM+ fit-tumur żdied meta mqabbel mal-axxite (Figura 1D). Osservajna wkoll differenza metabolika ċara bejn il-komponenti taċ-ċelloli EpCAM+ u EpCAM-. Iċ-ċelloli EpCAM+ (tumur) għandhom assorbiment tal-glukożju u attività mitokondrijali ogħla miċ-ċelloli EpCAM-, li hija ħafna ogħla mill-attività metabolika tal-fibroblasti fiċ-ċelloli tat-tumur fit-TME (Figura 1, E u F).
(A u B) Intensità medjana tal-fluworexxenza (MFI) tal-assorbiment tal-glukożju (2-NBDG) (A) u attività mitokondrijali taċ-ċelloli T CD4 + (MitoTracker aħmar skur) (B) Graffs rappreżentattivi (xellug) u dejta tabulata (Lemin), ċelloli T CD8 + u ċelloli tat-tumur EpCAM + CD45 minn axxite u tumur. (Ċ) Il-proporzjon taċ-ċelloli CD4 + u CD8 + (taċ-ċelloli T CD3 +) fl-axxite u t-tumur. (D) Proporzjon taċ-ċelloli tat-tumur EpCAM + fl-axxite u t-tumur (CD45−). (E u F) Assorbiment tal-glukożju EpCAM + CD45-tumur u EpCAM-CD45-matriċi (2-NBDG) (E) u attività mitokondrijali (MitoTracker aħmar skur) (F) graffs rappreżentattivi (xellug) u dejta tabulata (Lemin) Axxite u ċelloli tat-tumur. (G) Graffs rappreżentattivi tal-espressjoni CD25, CD137 u PD1 permezz ta' ċitometrija tal-fluss. (H u I) Espressjoni ta' CD25, CD137 u PD1 fuq ċelluli T CD4 + (H) u ċelluli T CD8 + (I). (J u K) Fenotipi Naive, memorja ċentrali (Tcm), effettur (Teff) u memorja effettur (Tem) ibbażati fuq l-espressjoni ta' CCR7 u CD45RO. Immaġni rappreżentattivi (xellug) u dejta tabulari (lemin) ta' ċelluli T CD4 + (J) u ċelluli T CD8 + (K) f'axxite u tumuri. Valuri P determinati minn t-test imqabbel (*P<0.05, **P<0.01 u ***P<0.001). Il-linja tirrappreżenta pazjenti mqabbla (n = 6). FMO, fluworexxenza nieqes wieħed; MFI, intensità medjana tal-fluworexxenza.
Analiżi ulterjuri żvelat differenzi sinifikanti oħra bejn l-istatus fenotipiku taċ-ċelluli T b'riżoluzzjoni għolja. Il-memorja attivata (Figura 1, G sa I) u l-memorja effettur (Figura 1, J u K) fit-tumuri huma ħafna aktar frekwenti milli fl-axxite (proporzjon ta' ċelluli T CD3+). Bl-istess mod, l-analiżi tal-fenotip bl-espressjoni ta' markaturi ta' attivazzjoni (CD25 u CD137) u markaturi ta' tnaqqis [proteina tal-mewt taċ-ċelluli pprogrammata 1 (PD1)] uriet li għalkemm il-karatteristiċi metaboliċi ta' dawn il-popolazzjonijiet huma differenti (Figura S1, B sa E), ma ġew osservati l-ebda differenzi metaboliċi sinifikanti bejn sottogruppi naive, effettur jew memorja (Figura S1, F sa I). ​​Dawn ir-riżultati ġew ikkonfermati bl-użu ta' metodi ta' tagħlim awtomatiku biex jiġu assenjati awtomatikament fenotipi taċ-ċelluli (21), li żvelaw ukoll il-preżenza ta' numru kbir ta' ċelluli tal-mudullun (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) fl-axxite tal-pazjent (Figura S2A). Fost it-tipi kollha ta' ċelluli identifikati, din il-popolazzjoni ta' ċelluli mijelojdi wriet l-ogħla assorbiment tal-glukożju u attività mitokondrijali (Figura S2, B sa G). Dawn ir-riżultati jenfasizzaw id-differenzi metaboliċi qawwija bejn it-tipi multipli ta' ċelluli misjuba fl-axxite u t-tumuri f'pazjenti bl-HGSC.
L-isfida ewlenija fil-fehim tal-karatteristiċi metabonomiċi tat-TIL hija l-ħtieġa li jiġu iżolati kampjuni taċ-ċelluli T ta’ purità, kwalità u kwantità suffiċjenti mit-tumuri. Studji reċenti wrew li l-metodi ta’ għażla u arrikkiment tal-beads ibbażati fuq iċ-ċitometrija tal-fluss jistgħu jwasslu għal bidliet fil-profili tal-metaboliti ċellulari (22-24). Biex negħlbu din il-problema, ottimizzajna l-metodu ta’ arrikkiment tal-beads biex niżolaw u niżolaw it-TIL minn kanċer tal-ovarji umani mneħħi kirurġikament qabel l-analiżi permezz ta’ LC-MS/MS (ara Materjali u Metodi; Figura 2A). Sabiex nivvalutaw l-impatt ġenerali ta’ dan il-protokoll fuq il-bidliet fil-metaboliti, qabbilna l-profili tal-metaboliti taċ-ċelluli T attivati ​​minn donaturi b’saħħithom wara l-pass ta’ separazzjoni tal-beads ta’ hawn fuq ma’ ċelluli li ma ġewx separati bil-beads iżda baqgħu fuq is-silġ. Din l-analiżi tal-kontroll tal-kwalità sabet li hemm korrelazzjoni għolja bejn dawn iż-żewġ kundizzjonijiet (r = 0.77), u r-ripetibbiltà teknika tal-grupp ta’ 86 metabolit għandha ripetibbiltà għolja (Figura 2B). Għalhekk, dawn il-metodi jistgħu jwettqu analiżi preċiża tal-metaboliti f'ċelloli li jkunu qed jiġu arrikkit mit-tip ta' ċellula, u b'hekk jipprovdu l-ewwel pjattaforma b'riżoluzzjoni għolja għall-identifikazzjoni ta' metaboliti speċifiċi fl-HGSC, u b'hekk jippermettu lin-nies jiksbu fehim aktar profond tal-ispeċifiċità taċ-ċelloli tal-programm tal-metaboliżmu sesswali.
(A) Dijagramma skematika tal-arrikkiment tal-perli manjetiċi. Qabel l-analiżi permezz ta' LC-MS/MS, iċ-ċelloli jgħaddu minn tliet rawnds konsekuttivi ta' arrikkiment tal-perli manjetiċi jew jibqgħu fuq is-silġ. (B) L-effett tat-tip ta' arrikkiment fuq l-abbundanza tal-metaboliti. Il-medja ta' tliet kejl għal kull tip ta' arrikkiment ± SE. Il-linja griża tirrappreżenta relazzjoni 1:1. Il-korrelazzjoni intra-klassi (ICC) ta' kejl ripetut murija fit-tikketta tal-assi. NAD, nikotinamide adenina dinukleotide. (Ċ) Dijagramma skematika tal-fluss tax-xogħol tal-analiżi tal-metaboliti tal-pazjent. L-axxite jew it-tumuri jinġabru mill-pazjenti u jiġu krijopreservati. Porzjon żgħir ta' kull kampjun ġie analizzat permezz ta' ċitometrija tal-fluss, filwaqt li l-kampjuni li fadal għaddew minn tliet rawnds ta' arrikkiment għal ċelloli CD4+, CD8+ u CD45-. Dawn il-frazzjonijiet taċ-ċelloli ġew analizzati bl-użu ta' LC-MS/MS. (D) Mappa tas-sħana tal-abbundanza standardizzata tal-metaboliti. Id-dendrogramma tirrappreżenta l-clustering ta' Ward tad-distanzi Ewklidejani bejn il-kampjuni. (E) Analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA) tal-mappa tal-metaboliti tal-kampjun, li turi tliet repliki ta' kull kampjun, il-kampjuni mill-istess pazjent huma konnessi b'linja. (F) Il-PCA tal-profil tal-metaboliti tal-kampjun ikkundizzjonat fuq il-pazjent (jiġifieri, bl-użu ta' ridondanza parzjali); it-tip ta' kampjun huwa limitat mill-qafas konvess. PC1, komponent prinċipali 1; PC2, komponent prinċipali 2.
Sussegwentement, applikajna dan il-metodu ta' arrikkiment biex nanalizzaw 99 metabolit fil-frazzjonijiet taċ-ċelluli CD4+, CD8+ u CD45- fl-axxite primarja u t-tumuri ta' sitt pazjenti bl-HGSC (Figura 2C, Figura S3A u Tabella S3 u S4). Il-popolazzjoni ta' interess tirrappreżenta minn 2% sa 70% tal-kampjun kbir oriġinali ta' ċelluli ħajjin, u l-proporzjon taċ-ċelluli jvarja ħafna bejn il-pazjenti. Wara li sseparajna ż-żibeġ, il-frazzjoni arrikkita ta' interess (CD4+, CD8+ jew CD45-) tirrappreżenta aktar minn 85% taċ-ċelluli ħajjin kollha fil-kampjun bħala medja. Dan il-metodu ta' arrikkiment jippermettilna nanalizzaw il-popolazzjonijiet taċ-ċelluli mill-metaboliżmu tat-tessut tat-tumur uman, li huwa impossibbli li jsir minn kampjuni kbar. Bl-użu ta' dan il-protokoll, iddeterminajna li l-kynurenine u adenosine, dawn iż-żewġ metaboliti immunosoppressivi kkaratterizzati sew, kienu elevati fiċ-ċelluli T tat-tumur jew fiċ-ċelluli tat-tumur (Figura S3, B u C). Għalhekk, dawn ir-riżultati juru l-fedeltà u l-abbiltà tat-teknoloġija tagħna ta' separazzjoni taċ-ċelluli u spettrometrija tal-massa biex issib metaboliti bijoloġikament importanti fit-tessuti tal-pazjent.
L-analiżi tagħna żvelat ukoll separazzjoni metabolika qawwija tat-tipi ta’ ċelluli fi ħdan u bejn il-pazjenti (Figura 2D u Figura S4A). B’mod partikolari, meta mqabbel ma’ pazjenti oħra, il-pazjent 70 wera karatteristiċi metaboliċi differenti (Figura 2E u Figura S4B), li jindikaw li jista’ jkun hemm eteroġeneità metabolika sostanzjali bejn il-pazjenti. Ta’ min jinnota li meta mqabbel ma’ pazjenti oħra (1.2 sa 2 litri; Tabella S1), l-ammont totali ta’ axxite miġbur fil-pazjent 70 (80 ml) kien iżgħar. Il-kontroll tal-eteroġeneità bejn il-pazjenti waqt l-analiżi tal-komponenti prinċipali (pereżempju, bl-użu ta’ analiżi ta’ ridondanza parzjali) juri bidliet konsistenti bejn it-tipi ta’ ċelluli, u t-tipi ta’ ċelluli u/jew il-mikroambjent huma aggregati b’mod ċar skont il-profil tal-metabolit (Figura 2F). L-analiżi ta’ metaboliti singoli enfasizzat dawn l-effetti u żvelat differenzi sinifikanti bejn it-tipi ta’ ċelluli u l-mikroambjent. Ta’ min jinnota li l-aktar differenza estrema osservata hija l-MNA, li ġeneralment hija arrikkita f’ċelluli CD45- u f’ċelluli CD4+ u CD8+ li jinfiltraw it-tumur (Figura 3A). Għaċ-ċelloli CD4+, dan l-effett huwa l-aktar ovvju, u l-MNA fiċ-ċelloli CD8+ jidher ukoll li huwa affettwat ħafna mill-ambjent. Madankollu, dan mhux importanti, għaliex tlieta biss mis-sitt pazjenti jistgħu jiġu evalwati għall-punteġġi tas-CD8+ tat-tumur. Minbarra l-MNA, f'tipi differenti ta' ċelloli fl-axxite u t-tumuri, metaboliti oħra li mhumiex ikkaratterizzati sew fit-TIL huma wkoll rikki b'mod differenzjali (Figuri S3 u S4). Għalhekk, din id-dejta tiżvela sett promettenti ta' metaboliti immunomodulatorji għal aktar riċerka.
(A) Kontenut normalizzat ta' MNA f'ċelluli CD4+, CD8+ u CD45- minn axxite u tumur. Il-plott tal-kaxxa juri l-medjan (linja), il-medda interkwartili (frame hinge) u l-medda tad-dejta, sa 1.5 darbiet il-medda interkwartili (frame whisker). Kif deskritt fil-Materjali u l-Metodi tal-Pazjent, uża l-valur limma tal-pazjent biex tiddetermina l-valur P (*P<0.05 u **P<0.01). (B) Dijagramma skematika tal-metaboliżmu tal-MNA (60). Metaboliti: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. Enżimi (aħdar): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, purine nucleoside phosphorylase. (Ċ) t-SNE ta' scRNA-seq ta' axxite (griż) u tumur (aħmar; n = 3 pazjenti). (D) Espressjoni ta' NNMT f'popolazzjonijiet ta' ċelluli differenti identifikati bl-użu ta' scRNA-seq. (E) Espressjoni ta' NNMT u AOX1 f'SK-OV-3, kliewi embrijoniku uman (HEK) 293T, ċelluli T u ċelluli T ittrattati b'MNA. L-espressjoni mitwija hija murija relattiva għal SK-OV-3. Il-mudell ta' espressjoni b'SEM huwa muri (n = 6 donaturi b'saħħithom). Valuri Ct akbar minn 35 huma kkunsidrati li ma jistgħux jiġu osservati (UD). (F) Espressjoni ta' SLC22A1 u SLC22A2 f'ċelluli SK-OV-3, HEK293T, ċelluli T u ċelluli T ittrattati bi 8mM MNA. L-espressjoni mitwija hija murija relattiva għal SK-OV-3. Il-mudell ta' espressjoni b'SEM huwa muri (n = 6 donaturi b'saħħithom). Valuri Ct akbar minn 35 huma kkunsidrati li ma jistgħux jiġu osservati (UD). (G) Kontenut ta' MNA taċ-ċelluli f'ċelluli T donaturi b'saħħithom attivati ​​wara 72 siegħa ta' inkubazzjoni b'MNA. Il-mudell ta' espressjoni b'SEM huwa muri (n = 4 donaturi b'saħħithom).
L-MNA jiġi prodott billi jiġi trasferit il-grupp metil minn S-adenosyl-1-methionine (SAM) għal nicotinamide (NA) permezz ta' nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Figura 3B). L-NNMT huwa espress żżejjed f'varjetà ta' kanċers umani u huwa assoċjat ma' proliferazzjoni, invażjoni u metastasi (25-27). Biex nifhmu aħjar is-sors tal-MNA fiċ-ċelloli T fit-TME, użajna scRNA-seq biex nikkaratterizzaw l-espressjoni tal-NNMT fit-tipi ta' ċelloli fl-axxite u t-tumuri ta' tliet pazjenti bl-HGSC (Tabella S5). Analiżi ta' madwar 6,500 ċellula wriet li f'ambjenti ta' axxite u tumuri, l-espressjoni tal-NNMT kienet ristretta għall-popolazzjonijiet preżunti taċ-ċelloli tal-fibroblasti u tat-tumur (Figura 3, C u D). Ta' min jinnota li m'hemm l-ebda espressjoni ovvja tal-NNMT f'xi popolazzjoni li tesprimi PTPRC (CD45 +) (Figura 3D u Figura S5A), li jindika li l-MNA skopert fl-ispettru tal-metabolit ġie introdott fiċ-ċelloli T. L-espressjoni ta' aldehyde oxidase 1 (AOX1) tikkonverti l-MNA f'1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) jew 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4-PYR); Figura 3B) hija wkoll ristretta għall-popolazzjoni ta' fibroblasti li jesprimu COL1A1 (Figura S5A), li flimkien jindikaw li ċ-ċelloli T m'għandhomx il-kapaċità tal-metaboliżmu konvenzjonali tal-MNA. Il-mudell ta' espressjoni ta' dawn il-ġeni relatati mal-MNA ġie vverifikat bl-użu ta' sett ta' dejta taċ-ċelloli indipendenti ieħor minn axxite minn pazjenti bl-HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). Barra minn hekk, l-analiżi kwantitattiva tar-reazzjoni katina tal-polimerażi (qPCR) ta' ċelloli T donaturi b'saħħithom ittrattati bl-MNA wriet li meta mqabbla maċ-ċelloli tat-tumur ovarjan SK-OV-3 ta' kontroll, NNMT jew AOX1 kważi ma kinux espressi (Figura 3E). Dawn ir-riżultati mhux mistennija jindikaw li l-MNA jista' jiġi sekretat minn fibroblasti jew tumuri f'ċelloli T biswit it-TME.
Għalkemm il-kandidati jinkludu l-familja ta' trasportaturi ta' katjoni organiċi 1 sa 3 (OCT1, OCT2 u OCT3) kodifikati mill-familja tat-trasportatur solubbli 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 u SLC22A3), it-trasportaturi potenzjali tal-MNA għadhom mhux definiti (28). Il-QPCR tal-mRNA minn ċelluli T donaturi b'saħħithom wera livelli baxxi ta' espressjoni ta' SLC22A1 iżda livelli mhux skoperti ta' SLC22A2, li kkonferma li kien ġie rrappurtat qabel fil-letteratura (Figura 3F) (29). B'kuntrast, il-linja taċ-ċelluli tat-tumur ovarjan SK-OV-3 esprimiet livelli għoljin taż-żewġ trasportaturi (Figura 3F).
Sabiex tiġi ttestjata l-possibbiltà li ċ-ċelloli T għandhom il-ħila li jassorbu MNA barrani, ċelloli T donaturi b'saħħithom ġew ikkultivati ​​għal 72 siegħa fil-preżenza ta' konċentrazzjonijiet differenti ta' MNA. Fin-nuqqas ta' MNA eżoġenu, il-kontenut ċellulari ta' MNA ma jistax jiġi skopert (Figura 3G). Madankollu, ċelloli T attivati ​​ttrattati b'MNA eżoġenu wrew żieda dipendenti mid-doża fil-kontenut ta' MNA fiċ-ċelloli, sa 6 mM MNA (Figura 3G). Dan ir-riżultat jindika li minkejja l-livell baxx ta' espressjoni tat-trasportatur u n-nuqqas tal-enzima ewlenija responsabbli għall-metaboliżmu intraċellulari tal-MNA, it-TIL xorta jista' jassorbi l-MNA.
L-ispettru tal-metaboliti fiċ-ċelloli T tal-pazjenti u l-esperimenti in vitro tal-assorbiment tal-MNA jżidu l-possibbiltà li l-fibroblasti assoċjati mal-kanċer (CAF) inixxu l-MNA u ċ-ċelloli tat-tumur jistgħu jirregolaw il-fenotip u l-funzjoni tat-TIL. Biex jiġi determinat l-effett tal-MNA fuq iċ-ċelloli T, ċelloli T donaturi b'saħħithom ġew attivati ​​in vitro fil-preżenza jew fin-nuqqas ta' MNA, u l-proliferazzjoni u l-produzzjoni taċ-ċitokini tagħhom ġew evalwati. Wara 7 ijiem taż-żieda tal-MNA fl-ogħla doża, in-numru ta' rduppjar tal-popolazzjoni tnaqqas moderatament, filwaqt li l-vigor inżamm fid-dożi kollha (Figura 4A). Barra minn hekk, it-trattament tal-MNA eżoġenu rriżulta f'żieda fil-proporzjon ta' ċelloli T CD4+ u CD8+ li jesprimu l-fattur tan-nekrożi tat-tumur-α (TNFα; Figura 4B). B'kuntrast, il-produzzjoni intraċellulari ta' IFN-γ tnaqqset b'mod sinifikanti fiċ-ċelloli T CD4+, iżda mhux fiċ-ċelloli T CD8+, u ma kien hemm l-ebda bidla sinifikanti fl-interleukin 2 (IL-2; Figura 4, C u D). Għalhekk, l-analiżi immunosorbenti marbuta mal-enzimi (ELISA) tas-supernatanti minn dawn il-kulturi taċ-ċelluli T ittrattati bl-MNA wriet żieda sinifikanti fit-TNFα, tnaqqis fl-IFN-γ, u l-ebda bidla fl-IL-2 (Figura 4, E sa G). It-tnaqqis tal-IFN-γ jindika li l-MNA jista' jkollu rwol fl-inibizzjoni tal-attività kontra t-tumur taċ-ċelluli T. Sabiex jiġi simulat l-effett tal-MNA fuq iċ-ċitotossiċità medjata miċ-ċelluli T, ċelluli tar-riċettur tal-antiġen kimeriku T (FRα-CAR-T) li jimmiraw lejn ir-riċettur tal-folat α u ċ-ċelluli CAR-T (GFP) regolati minn ċelluli tal-proteina fluworexxenti ħadra (GFP) -CAR-T) huma prodotti minn ċelluli mononukleari tad-demm periferali ta' donatur b'saħħtu (PBMC). Iċ-ċelluli CAR-T ġew ikkultivati ​​għal 24 siegħa fil-preżenza tal-MNA, u mbagħad ikkultivati ​​flimkien ma' ċelluli tat-tumur tal-ovarji SK-OV-3 umani li jesprimu r-riċettur tal-folat α f'proporzjon ta' effettur għal mira ta' 10:1. It-trattament bl-MNA rriżulta fi tnaqqis sinifikanti fl-attività ta' qtil taċ-ċelloli FRα-CAR-T, li kienet simili għaċ-ċelloli FRα-CAR-T ittrattati bl-adenosine (Figura 4H).
(A) Għadd totali ta' ċelluli vijabbli u rduppjar tal-popolazzjoni (PD) direttament mill-kultura fil-jum 7. Il-graff tal-bars jirrappreżenta l-medja + SEM ta' sitt donaturi b'saħħithom. Jirrappreżenta dejta minn mill-inqas n = 3 esperimenti indipendenti. (B sa D) CD3/CD28 u IL-2 intużaw biex jattivaw iċ-ċelluli T fil-konċentrazzjonijiet rispettivi tagħhom ta' MNA għal 7 ijiem. Qabel l-analiżi, iċ-ċelluli ġew stimulati b'PMA/ionomycin b'GolgiStop għal 4 sigħat. Espressjoni ta' TNFα (B) fiċ-ċelluli T. Eżempju ta' immaġni (xellug) u dejta tabulari (lemin) tal-espressjoni ta' TNFα fiċ-ċelluli ħajjin. Espressjoni ta' IFN-γ (C) u IL-2 (D) fiċ-ċelluli T. L-espressjoni taċ-ċitokini tkejlet permezz ta' ċitometrija tal-fluss. Il-graff tal-bars jirrappreżenta l-medja (n = 6 donaturi b'saħħithom) + SEM. Uża analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda u miżuri ripetuti (*P<0.05 u **P<0.01) biex tiddetermina l-valur P. Jirrappreżenta dejta minn mill-inqas n = 3 esperimenti indipendenti. (E sa G) CD3/CD28 u IL-2 intużaw biex jattivaw iċ-ċelloli T fil-konċentrazzjonijiet rispettivi tagħhom ta' MNA għal 7 ijiem. Il-mezz inġabar qabel u wara 4 sigħat ta' stimulazzjoni PMA/ionomycin. Il-konċentrazzjonijiet ta' TNFα (E), IFN-γ (F) u IL-2 (G) tkejlu permezz ta' ELISA. Il-graff bil-vireg jirrappreżenta l-medja (n = 5 donaturi b'saħħithom) + SEM. Il-valur P determinat bl-użu ta' analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda u kejl ripetut (*P<0.05). Il-linja bit-tikek tindika l-limitu ta' skoperta tad-detezzjoni. (H) Analiżi tal-liżi taċ-ċelloli. Iċ-ċelloli FRα-CAR-T jew GFP-CAR-T ġew aġġustati b'adenosine (250μM) jew MNA (10 mM) għal 24 siegħa, jew tħallew mhux trattati (Ctrl). Il-perċentwal tal-qtil taċ-ċelloli SK-OV-3 tkejjel. Il-valur P determinat bit-test Welch t (*P<0.5 u **P<0.01).
Sabiex jinkiseb fehim mekkanistiku tar-regolazzjoni tal-espressjoni tat-TNFα dipendenti fuq l-MNA, ġew evalwati l-bidliet fl-mRNA tat-TNFα taċ-ċelloli T ittrattati bl-MNA (Figura 5A). Ċelloli T donaturi b'saħħithom ittrattati bl-MNA wrew żieda doppja fil-livelli ta' traskrizzjoni tat-TNFα, li jindika li l-MNA jiddependi fuq ir-regolazzjoni tat-traskrizzjoni tat-TNFα. Biex jiġi investigat dan il-mekkaniżmu regolatorju possibbli, żewġ fatturi ta' traskrizzjoni magħrufa li jirregolaw it-TNFα, jiġifieri l-fattur nukleari taċ-ċelloli T attivat (NFAT) u l-proteina speċifika 1 (Sp1), ġew evalwati b'reazzjoni għall-irbit tal-MNA mal-promotur prossimali tat-TNFα (30). Il-promotur tat-TNFα fih 6 siti ta' rbit identifikati tal-NFAT u 2 siti ta' rbit ta' Sp1, li jikkoinċidu f'sit wieħed [-55 par ta' bażijiet (bp) mill-5'cap] (30). L-immunopreċipitazzjoni tal-kromatina (ChIP) uriet li meta ttrattat bl-MNA, l-irbit ta' Sp1 mal-promotur tat-TNFα żdied bi tliet darbiet. L-inkorporazzjoni tal-NFAT żdiedet ukoll u resqet lejn l-importanza (Figura 5B). Din id-dejta tindika li l-MNA tirregola l-espressjoni ta' TNFα permezz tat-traskrizzjoni ta' Sp1, u sa ċertu punt l-espressjoni ta' NFAT.
(A) Meta mqabbla maċ-ċelloli T ikkultivati ​​mingħajr MNA, il-bidla fil-ħin tal-espressjoni tat-TNFα fiċ-ċelloli T ittrattati bl-MNA. Il-mudell tal-espressjoni b'SEM huwa muri (n = 5 donaturi b'saħħithom). Jirrappreżenta dejta minn mill-inqas n = 3 esperimenti indipendenti. (B) Il-promotur tat-TNFα taċ-ċelloli T ittrattati bi jew mingħajr 8 mM MNA wara li NFAT u Sp1 ġew ikkombinati ma' (Ctrl) u stimulazzjoni PMA/ionomycin għal 4 sigħat. Immunoglobulin G (IgG) u H3 intużaw bħala kontrolli negattivi u pożittivi għall-immunopreċipitazzjoni, rispettivament. Il-kwantifikazzjoni ta' ChIP uriet li l-irbit ta' Sp1 u NFAT mal-promotur tat-TNFα fiċ-ċelloli ttrattati bl-MNA żdied diversi drabi meta mqabbel mal-kontroll. Jirrappreżenta dejta minn mill-inqas n = 3 esperimenti indipendenti. Valur P determinat minn testijiet-t multipli (*** P <0.01). (C) Meta mqabbla mal-axxite tal-HGSC, iċ-ċelloli T (mhux ċitotossiċi) urew żieda fl-espressjoni tat-TNF fit-tumur. Il-kuluri jirrappreżentaw pazjenti differenti. Iċ-ċelloli murija ġew kampjunati b'mod każwali sa 300 u jittered biex jillimitaw l-overdrawing (** Padj = 0.0076). (D) Mudell propost ta' MNA għall-kanċer tal-ovarji. L-MNA jiġi prodott fiċ-ċelloli tat-tumur u l-fibroblasti fit-TME u jiġi assorbit miċ-ċelloli T. L-MNA jżid l-irbit ta' Sp1 mal-promotur TNFα, u jwassal għal żieda fit-traskrizzjoni tat-TNFα u l-produzzjoni taċ-ċitokina TNFα. L-MNA jikkawża wkoll tnaqqis fl-IFN-γ. L-inibizzjoni tal-funzjoni taċ-ċelloli T twassal għal tnaqqis fil-kapaċità ta' qtil u tkabbir aċċellerat tat-tumur.
Skont rapporti, it-TNFα għandu effetti kontra t-tumur u kontra t-tumur dipendenti fuq quddiem u wara, iżda għandu rwol magħruf sew fil-promozzjoni tat-tkabbir u l-metastasi tal-kanċer tal-ovarji (31-33). Skont rapporti, il-konċentrazzjoni ta' TNFα fl-axxite u fit-tessuti tat-tumur f'pazjenti bil-kanċer tal-ovarji hija ogħla minn dik fit-tessuti beninni (34-36). F'termini ta' mekkaniżmu, it-TNFα jista' jirregola l-attivazzjoni, il-funzjoni u l-proliferazzjoni taċ-ċelluli bojod tad-demm, u jibdel il-fenotip taċ-ċelluli tal-kanċer (37, 38). Konsistenti ma' dawn is-sejbiet, l-analiżi differenzjali tal-espressjoni tal-ġeni wriet li t-TNF kien regolat b'mod sinifikanti fiċ-ċelluli T fit-tessuti tat-tumur meta mqabbel mal-axxite (Figura 5C). Iż-żieda fl-espressjoni tat-TNF kienet evidenti biss f'popolazzjonijiet ta' ċelluli T b'fenotip mhux ċitotossiku (Figura S5A). Fil-qosor, din id-dejta tappoġġja l-fehma li l-MNA għandu effetti doppji immunosoppressivi u ta' promozzjoni tat-tumur fl-HGSC.
It-tikkettar fluworexxenti bbażat fuq iċ-ċitometrija tal-fluss sar il-metodu ewlieni għall-istudju tal-metaboliżmu tat-TIL. Dawn l-istudji wrew li meta mqabbla mal-limfoċiti tad-demm periferali jew iċ-ċelloli T minn organi limfojdi sekondarji, it-TIL murini u umani għandhom tendenza ogħla li jassorbu l-glukożju (4, 39) u t-telf gradwali tal-funzjoni mitokondrijali (19, 40). Għalkemm osservajna riżultati simili f'dan l-istudju, l-iżvilupp ewlieni huwa li jitqabbel il-metaboliżmu taċ-ċelloli tat-tumur u t-TIL mill-istess tessut tat-tumur imneħħi. Konsistenti ma' wħud minn dawn ir-rapporti preċedenti, iċ-ċelloli tat-tumur (CD45-EpCAM +) mill-axxite u t-tumuri għandhom assorbiment ogħla tal-glukożju miċ-ċelloli T CD8 + u CD4 +, li jappoġġja l-fatt li l-assorbiment għoli tal-glukożju taċ-ċelloli tat-tumur jista' jitqabbel maċ-ċelloli T. Il-kunċett tal-kompetizzjoni taċ-ċelloli T. TME. Madankollu, l-attività mitokondrijali taċ-ċelloli tat-tumur hija ogħla minn dik taċ-ċelloli T CD8 +, iżda l-attività mitokondrijali hija simili għal dik taċ-ċelloli T CD4 +. Dawn ir-riżultati jsaħħu t-tema emerġenti li l-metaboliżmu ossidattiv huwa importanti għaċ-ċelloli tat-tumur (41, 42). Jissuġġerixxu wkoll li ċ-ċelloli T CD8+ jistgħu jkunu aktar suxxettibbli għal disfunzjoni ossidattiva miċ-ċelloli T CD4+, jew li ċ-ċelloli T CD4+ jistgħu jużaw sorsi ta' karbonju għajr il-glukożju biex iżommu l-attività mitokondrijali (43, 44). Għandu jiġi nnutat li ma osservajna l-ebda differenza fl-assorbiment tal-glukożju jew fl-attività mitokondrijali bejn l-effetturi T CD4+, il-memorja tal-effettur T u ċ-ċelloli tal-memorja ċentrali T fl-axxite. Bl-istess mod, l-istat ta' differenzjazzjoni taċ-ċelloli T CD8+ fit-tumuri m'għandu x'jaqsam xejn mal-bidliet fl-assorbiment tal-glukożju, u dan jenfasizza d-differenza sinifikanti bejn iċ-ċelloli T ikkultivati ​​in vitro u t-TIL uman in vivo (22). Dawn l-osservazzjonijiet ġew ikkonfermati wkoll bl-użu ta' allokazzjoni awtomatika imparzjali tal-popolazzjoni taċ-ċelloli, li żvelat aktar li ċ-ċelloli CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ b'assorbiment tal-glukożju u attività mitokondrijali ogħla miċ-ċelloli tat-tumur huma prevalenti iżda għandhom popolazzjoni ta' ċelloli Metabolika attiva. Din il-popolazzjoni tista' tirrappreżenta s-sottopopolazzjoni putattiva ta' ċelloli suppressori mijelojdi jew ċelloli dendritiċi plażmaċitojdi identifikati fl-analiżi scRNA-seq. Għalkemm dawn it-tnejn ġew irrappurtati f'tumuri ovarjani umani [45], xorta jeħtieġu aktar xogħol biex tiġi deskritta din is-subpopolazzjoni mijelojde.
Għalkemm metodi bbażati fuq iċ-ċitometrija tal-fluss jistgħu jiċċaraw id-differenzi ġenerali fil-metaboliżmu tal-glukożju u ossidattiv bejn it-tipi ta' ċelluli, il-metaboliti preċiżi prodotti mill-glukożju jew minn sorsi oħra tal-karbonju għall-metaboliżmu mitokondrijali fit-TME għadhom ma ġewx determinati. L-assenjazzjoni tal-preżenza jew l-assenza ta' metaboliti lil sottosett TIL partikolari teħtieġ purifikazzjoni tal-popolazzjoni taċ-ċelluli mit-tessut eċiżat. Għalhekk, il-metodu tagħna ta' arrikkiment taċ-ċelluli flimkien mal-ispettrometrija tal-massa jista' jipprovdi għarfien dwar il-metaboliti li huma arrikkiti b'mod differenti fiċ-ċelluli T u l-popolazzjonijiet taċ-ċelluli tat-tumur f'kampjuni ta' pazjenti li jaqblu. Għalkemm dan il-metodu għandu vantaġġi fuq l-issortjar taċ-ċelluli attivati ​​bil-fluworexxenza, ċerti libreriji tal-metaboliti jistgħu jiġu affettwati minħabba l-istabbiltà inerenti u/jew ir-rata ta' tibdil rapida (22). Madankollu, il-metodu tagħna kien kapaċi jidentifika żewġ metaboliti immunosoppressivi rikonoxxuti, adenosine u kynurenine, għaliex ivarjaw ħafna bejn it-tipi ta' kampjuni.
L-analiżi metabonomika tagħna tat-tumuri u s-sottotipi TIL tipprovdi aktar għarfien dwar ir-rwol tal-metaboliti fit-TME tal-ovarji. L-ewwel, bl-użu taċ-ċitometrija tal-fluss, iddeterminajna li ma kien hemm l-ebda differenza fl-attività mitokondrijali bejn it-tumuri u ċ-ċelloli T CD4+. Madankollu, l-analiżi LC-MS/MS żvelat bidliet sinifikanti fl-abbundanza tal-metaboliti fost dawn il-popolazzjonijiet, li jindika li l-konklużjonijiet dwar il-metaboliżmu tat-TIL u l-attività metabolika ġenerali tiegħu jeħtieġu interpretazzjoni bir-reqqa. It-tieni, l-MNA huwa l-metabolit bl-akbar differenza bejn iċ-ċelloli CD45 u ċ-ċelloli T fl-axxite, mhux fit-tumuri. Għalhekk, il-kompartimentalizzazzjoni u l-post tat-tumur jista' jkollhom effetti differenti fuq il-metaboliżmu tat-TIL, li jenfasizza l-eteroġeneità possibbli f'mikroambjent partikolari. It-tielet, l-espressjoni tal-enzima NNMT li tipproduċi l-MNA hija prinċipalment limitata għas-CAF, li hija ċelloli tat-tumur sa ċertu punt, iżda livelli ta' MNA li jistgħu jiġu skoperti huma osservati fiċ-ċelloli T derivati ​​mit-tumur. L-espressjoni żejda tal-NNMT fis-CAF tal-ovarji għandha effett magħruf li jippromwovi l-kanċer, parzjalment minħabba l-promozzjoni tal-metaboliżmu tas-CAF, l-invażjoni tat-tumur u l-metastasi (27). Għalkemm il-livell ġenerali ta' TIL huwa moderat, l-espressjoni ta' NNMT fis-CAF hija relatata mill-qrib mas-sottotip mesenkimali tal-Atlas tal-Ġenoma tal-Kanċer (TCGA), li huwa assoċjat ma' pronjosi ħażina (27, 46, 47). Fl-aħħar nett, l-espressjoni tal-enzima AOX1 responsabbli għad-degradazzjoni tal-MNA hija wkoll limitata għall-popolazzjoni tas-CAF, li jindika li ċ-ċelloli T m'għandhomx il-ħila li jimmetabolizzaw l-MNA. Dawn ir-riżultati jappoġġjaw l-idea li għalkemm hemm bżonn ta' aktar xogħol biex tiġi vverifikata din is-sejba, livelli għoljin ta' MNA fiċ-ċelloli T jistgħu jindikaw il-preżenza ta' mikroambjent tas-CAF immunosoppressiv.
Minħabba l-livell baxx ta' espressjoni tat-trasportaturi tal-MNA u l-livelli li ma jistgħux jiġu skoperti ta' proteini ewlenin involuti fil-metaboliżmu tal-MNA, il-preżenza tal-MNA fiċ-ċelloli T mhijiex mistennija. La l-NNMT u lanqas l-AOX1 ma setgħu jiġu skoperti permezz ta' analiżi scRNA-seq u qPCR immirata ta' żewġ koorti indipendenti. Dawn ir-riżultati jindikaw li l-MNA ma jiġix sintetizzat miċ-ċelloli T, iżda jiġi assorbit mit-TME tal-madwar. Esperimenti in vitro juru li ċ-ċelloli T għandhom it-tendenza li jakkumulaw MNA eżoġenu.
L-istudji in vitro tagħna wrew li l-MNA eżoġenu jikkaġuna l-espressjoni ta' TNFα fiċ-ċelloli T u jsaħħaħ l-irbit ta' Sp1 mal-promotur tat-TNFα. Għalkemm it-TNFα għandu kemm funzjonijiet kontra t-tumur kif ukoll kontra t-tumur, fil-kanċer tal-ovarji, it-TNFα jista' jippromwovi t-tkabbir tal-kanċer tal-ovarji (31-33). In-newtralizzazzjoni tat-TNFα fil-kultura taċ-ċelloli tat-tumur tal-ovarji jew l-eliminazzjoni tas-sinjal tat-TNFα f'mudelli tal-ġrieden jistgħu jtejbu l-produzzjoni taċ-ċitokini infjammatorji medjati mit-TNFα u jinibixxu t-tkabbir tat-tumur (32, 35). Għalhekk, f'dan il-każ, l-MNA derivat mit-TME jista' jaġixxi bħala metabolit pro-infjammatorju permezz ta' mekkaniżmu dipendenti mit-TNFα permezz tal-linja awtokrina, u b'hekk jippromwovi l-okkorrenza u t-tixrid tal-kanċer tal-ovarji (31). Abbażi ta' din il-possibbiltà, l-imblokk tat-TNFα qed jiġi studjat bħala aġent terapewtiku potenzjali għall-kanċer tal-ovarji (37, 48, 49). Barra minn hekk, l-MNA jfixkel iċ-ċitotossiċità taċ-ċelloli CAR-T għaċ-ċelloli tat-tumur tal-ovarji, u jipprovdi aktar evidenza għal soppressjoni immuni medjata mill-MNA. Kollettivament, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu mudell fejn it-tumuri u ċ-ċelloli CAF inixxu l-MNA fit-TME extraċellulari. Permezz ta' (i) stimulazzjoni tat-tkabbir tal-kanċer tal-ovarji indotta minn TNF u (ii) inibizzjoni tal-attività ċitotossika taċ-ċelloli T indotta minn MNA, dan jista' jkollu effett doppju tat-tumur (Figura 5D).
Bħala konklużjoni, bl-applikazzjoni ta' taħlita ta' arrikkiment rapidu taċ-ċelluli, sekwenzar ta' ċellula waħda u profiling metaboliku, dan l-istudju żvela d-differenzi immunometabolomiċi enormi bejn it-tumuri u ċ-ċelluli tal-axxite f'pazjenti bl-HGSC. Din l-analiżi komprensiva wriet li hemm differenzi fl-assorbiment tal-glukożju u l-attività mitokondrijali bejn iċ-ċelluli T, u identifikat l-MNA bħala metabolit regolatorju immuni awtonomu mhux taċ-ċelluli. Din id-dejta għandha impatt fuq kif it-TME taffettwa l-metaboliżmu taċ-ċelluli T fil-kanċers umani. Għalkemm ġiet irrappurtata l-kompetizzjoni diretta għan-nutrijenti bejn iċ-ċelluli T u ċ-ċelluli tal-kanċer, il-metaboliti jistgħu jaġixxu wkoll bħala regolaturi indiretti biex jippromwovu l-progressjoni tat-tumur u possibilment jrażżnu r-risponsi immuni endoġeni. Id-deskrizzjoni ulterjuri tar-rwol funzjonali ta' dawn il-metaboliti regolatorji tista' tiftaħ strateġiji alternattivi għat-titjib tar-rispons immuni kontra t-tumur.
Il-kampjuni tal-pazjenti u d-dejta klinika nkisbu permezz tar-repożitorju tat-tessuti tat-tumur tal-kanċer tal-BC iċċertifikat mill-Canadian Tissue Repository Network. Skont il-protokoll approvat mill-BC Cancer Research Ethics Committee u l-Università tal-British Columbia (H07-00463), il-kampjuni u d-dejta klinika tal-pazjenti kollha kisbu kunsens infurmat bil-miktub jew irrinunzjaw formalment għall-kunsens tagħhom. Il-kampjuni huma maħżuna fil-BioBank iċċertifikat (BRC-00290). Il-karatteristiċi dettaljati tal-pazjent huma murija fit-Tabelli S1 u S5. Għall-krijopreservazzjoni, jintuża skalpell biex jiddekomponi mekkanikament il-kampjun tat-tumur tal-pazjent u mbagħad jimbottah minn ġo filtru ta' 100 mikron biex tinkiseb sospensjoni ta' ċellula waħda. L-axxite tal-pazjent ġiet ċentrifugata b'1500 rpm għal 10 minuti f'4°C biex iċ-ċelloli jiġu pelletjati u jitneħħa s-supernatant. Iċ-ċelloli miksuba mit-tumur u l-axxite ġew krijopreservati f'50% serum AB uman inattivat bis-sħana (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) u 10% dimetil sulfossidu. Dawn is-sospensjonijiet ta' ċelloli singoli ppreservati ġew imdewba u użati għall-metabolomika u d-determinazzjoni tal-metaboliti deskritti hawn taħt.
Il-mezz komplut jikkonsisti minn 0.22 μm iffiltrat 50:50 supplimentat b'RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) supplimentat b'10% serum AB uman inattivat bis-sħana (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), soluzzjoni 1 x Penicillin Streptomycin (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) u 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) huwa supplimentat b'20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) u 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). Il-buffer tat-tebgħa taċ-ċitometru tal-fluss kien jikkonsisti minn 0.22 μm salina b'buffer tal-fosfat iffiltrata (PBS; Invitrogen) supplimentata bi 3% serum AB uman inattivat bis-sħana (Sigma). Il-buffer tal-arrikkiment taċ-ċelluli huwa magħmul minn PBS iffiltrat ta' 0.22μm u supplimentat b'0.5% serum AB uman inattivat bis-sħana (Sigma-Aldrich).
F'mezz komplut ta' 37°C, iċ-ċelloli ġew imtebbgħin b'10 nM MT DR u 100 μM 2-NBDG għal 30 minuta. Imbagħad, iċ-ċelloli ġew imtebbgħin biż-żebgħa tal-vijabbiltà eF506 f'4°C għal 15-il minuta. Erġa' ssospendi ċ-ċelloli f'FC Block (eBioscience) u Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), iddilwixxi f'flow cytometer staining buffer (skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur), u inkuba għal 10 minuti f'temperatura tal-kamra. Żebgħa ċ-ċelloli b'sett ta' antikorpi (Tabella S2) f'flow cytometry staining buffer f'4°C għal 20 minuta. Erġa' ssospendi ċ-ċelloli f'flow cytometry staining buffer (Cytek Aurora; konfigurazzjoni 3L-16V-14B-8R) qabel l-analiżi. Uża SpectroFlo u FlowJo V10 biex tanalizza d-dejta tal-għadd taċ-ċelloli, u uża GraphPad Prism 8 biex toħloq id-dejta. L-intensità medjana tal-fluworexxenza (MFI) ta' 2-NBDG u MT DR ġiet normalizzata bil-logaritmu, u mbagħad intuża test t imqabbel għal analiżi statistika biex jitqiesu l-pazjenti mqabbla. Neħħi l-popolazzjonijiet kollha b'inqas minn 40 avveniment mill-analiżi; daħħal valur MFI ta' 1 għal kwalunkwe valur negattiv qabel ma twettaq analiżi statistika u viżwalizzazzjoni tad-dejta.
Sabiex nissupplimentaw l-istrateġija manwali tal-gating tal-pannell tal-proċess ta' hawn fuq, użajna l-annotazzjoni sħiħa mis-siġra tar-restrizzjoni tal-forma (FAUST) (21) biex nassenjaw awtomatikament iċ-ċelloli lill-popolazzjoni wara li eliminajna ċ-ċelloli mejta f'FlowJo. Aħna nimmaniġġjaw l-output manwalment biex ngħaqqdu l-popolazzjonijiet li jidhru li huma allokati ħażin (ngħaqqdu ċ-ċelloli PD1+ maċ-ċelloli tat-tumur PD1) u l-popolazzjonijiet miżmuma. Kull kampjun fih medja ta' aktar minn 2% ċelloli, għal total ta' 11-il popolazzjoni.
Iċ-ċentrifugazzjoni tad-densità tal-gradjent tal-Ficoll intużat biex tissepara l-PBMC mill-prodotti tas-separazzjoni tal-lewkoċiti (STEMCELL Technologies). Iċ-ċelloli T CD8+ ġew iżolati mill-PBMC bl-użu ta' CD8 MicroBeads (Miltenyi) u espandew f'mezz komplut bl-użu ta' TransAct (Miltenyi) għal ġimagħtejn skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Iċ-ċelloli tħallew joqogħdu għal 5 ijiem f'mezz komplut li kien fih IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), u mbagħad ġew stimulati mill-ġdid b'TransAct. Fil-jum 7, skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur, intużaw CD45 MicroBeads umani (Miltenyi) biex jarrikkixxu ċ-ċelloli fi tliet rawnds konsekuttivi. Iċ-ċelloli ġew alikwotati għall-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss (kif deskritt hawn fuq), u miljun ċellula ġew alikwotati tliet darbiet għall-analiżi LC-MS/MS. Il-kampjuni ġew ipproċessati permezz ta' LC-MS/MS kif deskritt hawn taħt. Stmajna l-valur tal-metabolit nieqes b'numru ta' joni ta' 1,000. Kull kampjun jiġi normalizzat bin-numru totali ta' joni (TIC), konvertit logaritmikament u normalizzat awtomatikament f'MetaboAnalystR qabel l-analiżi.
Is-sospensjoni taċ-ċelluli singoli ta' kull pazjent ġiet imdewba u ffiltrata minn filtru ta' 40 μm f'mezz komplut (kif deskritt hawn fuq). Skont il-protokoll tal-manifattur, intużaw tliet rawnds konsekuttivi ta' selezzjoni pożittiva permezz ta' separazzjoni ta' żibeġ manjetiċi bl-użu ta' MicroBeads (Miltenyi) biex jarrikkixxu l-kampjuni għal ċelluli CD8+, CD4+ u CD45- (fuq is-silġ). Fil-qosor, iċ-ċelluli jerġgħu jiġu sospiżi f'buffer ta' arrikkiment taċ-ċelluli (kif deskritt hawn fuq) u jingħaddu. Iċ-ċelluli ġew inkubati b'żibeġ CD8 umani, żibeġ CD4 umani jew żibeġ CD45 umani (Miltenyi) f'4°C għal 15-il minuta, u mbagħad maħsula b'buffer ta' arrikkiment taċ-ċelluli. Il-kampjun jgħaddi mill-kolonna LS (Miltenyi), u l-frazzjonijiet pożittivi u negattivi jinġabru. Sabiex jitnaqqas it-tul ta' żmien u jiġi massimizzat il-pass ta' rkupru taċ-ċelluli, il-frazzjoni CD8 imbagħad tintuża għat-tieni rawnd ta' arrikkiment CD4+, u l-frazzjoni CD4 tintuża għall-arrikkiment CD45 sussegwenti. Żomm is-soluzzjoni fuq is-silġ matul il-proċess ta' separazzjoni.
Biex jitħejjew il-kampjuni għall-analiżi tal-metaboliti, iċ-ċelloli nħaslu darba b'soluzzjoni tal-melħ kiesaħ bis-silġ, u 1 ml ta' metanol ta' 80% ġie miżjud ma' kull kampjun, imbagħad ġie mħawwad bil-vortex u ffriżat malajr f'nitroġenu likwidu. Il-kampjuni ġew soġġetti għal tliet ċikli ta' ffriżar-tidwib u ċċentrifugati b'14,000 rpm għal 15-il minuta f'4°C. Is-supernatant li fih il-metaboliti jiġi evaporat sakemm jinxef. Il-metaboliti reġgħu nħalltu f'50 μl ta' 0.03% aċidu formiku, ġew mħawwad bil-vortex biex jitħalltu, u mbagħad ċċentrifugati biex jitneħħew id-debris.
Estrai l-metaboliti kif deskritt hawn fuq. Ittrasferixxi s-supernatant għal flixkun tal-kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja għar-riċerka metabolomika. Uża protokoll ta' trattament każwali biex tittratta kull kampjun b'numru simili ta' ċelloli biex tevita effetti tal-lott. Aħna wettaqna valutazzjoni kwalitattiva tal-metaboliti globali ppubblikati qabel fuq l-AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). L-analiżi kromatografika u l-integrazzjoni tal-erja tal-quċċata twettqu bl-użu tas-softwer MultiQuant verżjoni 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Għadd ta' joni ta' 1000 intuża biex jiġi stmat il-valur tal-metabolit nieqes, u t-TIC ta' kull kampjun intuża biex jiġi kkalkulat l-erja tal-quċċata normalizzata ta' kull metabolit skopert biex jiġi kkoreġut għall-bidliet introdotti mill-analiżi strumentali mill-ipproċessar tal-kampjun. Wara li t-TIC jiġi normalizzat, MetaboAnalystR(51) (parametru awtomatiku) jintuża għall-konverżjoni logaritmika u l-iskalar awtomatiku tal-linja tan-norma. Użajna PCA bil-pakkett vegan R biex inwettqu analiżi esploratorja tad-differenzi fil-metabolomi bejn it-tipi ta' kampjuni, u użajna analiżi ta' ridondanza parzjali biex nanalizzaw il-pazjenti. Użajna l-metodu Ward biex nibnu dendrogramma tal-mappa tas-sħana biex niġbru flimkien id-distanza Ewklidea bejn il-kampjuni. Użajna limma (52) fuq l-abbundanza standardizzata tal-metaboliti biex nidentifikaw metaboliti abbundanti b'mod differenti fit-tip ta' ċellula u l-mikroambjent kollu. Sabiex nissimplifikaw l-ispjegazzjoni, użajna l-parametru tal-medja tal-grupp biex nispeċifikaw il-mudell, u nikkunsidraw it-tipi ta' ċelluli fil-mikroambjent bħala kull grupp (n = 6 gruppi); għat-test tas-sinifikat, wettaqna tliet kejl ripetut għal kull metabolit. Sabiex nevitaw replikazzjoni falza, il-pazjent ġie inkluż bħala ostaklu fid-disinn tal-limma. Sabiex nivverifikaw id-differenzi fil-metaboliti bejn pazjenti differenti, aġġustajna l-mudell limma billi inkludejna l-pazjenti b'mod fiss. Irrappurtajna s-sinifikat tal-kuntrast speċifikat minn qabel bejn it-tip ta' ċellula u l-mikroambjent ta' Padj <0.05 (korrezzjoni ta' Benjamini-Hochberg).
Wara l-arrikkiment tal-vigor bl-użu tal-Miltenyi Dead Cell Removal Kit (vijabilità ta' >80%), sar sekwenzar tat-traskrittoma ta' ċellula waħda fuq il-kampjuni totali ta' axxite u tumuri ffriżati ħajjin bl-użu ta' protokoll ta' espressjoni tal-ġeni 10x 5′. Ġew analizzati ħames każijiet b'tumuri u axxite li jaqblu, għalkemm il-vijabilità baxxa minn kampjun wieħed tat-tumur ippreveniet l-inklużjoni tiegħu. Sabiex niksbu għażliet multipli ta' pazjenti, għaqqadna l-kampjuni ta' kull pazjent fil-korsiji tal-kontrollur tal-kromju 10x, u analizzajna s-siti tal-axxite u tat-tumur separatament. Wara s-sekwenzar [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), ġenoma ta' Quebec; B'medja ta' 73,488 u 41,378 qari għal kull ċellula għat-tumur u l-axxite rispettivament]], użajna CellSNP u Vireo (53) (ibbażati fuq CellSNP bħala L-SNP uman komuni (VCF) ipprovdut minn GRCh38 huwa assenjat identità ta' donatur. Nużaw SNPRelate biex niddeduċu l-eqreb identità (IBS) tal-istatus tal-ġenotip tal-pazjent (IBS), billi neskludu ċ-ċelloli mhux assenjati u ċ-ċelloli identifikati bħala duplexes u donaturi li jaqblu bejn l-axxite u l-kampjuni tat-tumur (54). Abbażi ta' dan il-kompitu, żammejna tliet każijiet b'rappreżentazzjoni abbundanti taċ-ċelloli fit-tumur u l-axxite għall-analiżi downstream. Wara li wettaqna pass ta' filtrazzjoni tal-massa fl-imballaġġ BioConductor scater (55) u scran (56), dan ipproduċa 6975 ċellula (2792 u 4183 ċellula mit-tumur u l-axxite, rispettivament) għall-analiżi. Nużaw ir-raggruppament Louvain (57) ta' igraph tan-netwerk tal-viċinat kondiviż (SNN) ibbażat fuq id-distanza ta' Jaccard għaċ-ċelloli tal-grupp minn espressjoni. Il-gruppi ġew annotati manwalment għal tipi ta' ċelluli putattivi bbażati fuq l-espressjoni tal-ġene markatur u viżwalizzati b't-SNE. Iċ-ċelluli T ċitotossiċi huma definiti mill-espressjoni ta' CD8A u GZMA, esklużi subgruppi b'espressjoni baxxa ta' proteina ribosomali. Aċċessajna d-dejta ppubblikata ta' Izar et al. (16), inkluż l-inkorporazzjoni tat-t-SNE tagħhom, tista' tikkontrolla l-koinċidenza tal-espressjoni bejn il-markaturi taċ-ċelluli immuni u l-espressjoni NNMT.
Il-PBMC ġew separati mill-prodotti tas-separazzjoni tal-lewkoċiti (STEMCELL Technologies) permezz ta' ċentrifugazzjoni tad-densità tal-gradjent ta' Ficoll. Iċ-ċelloli CD3+ ġew iżolati mill-PBMC bl-użu ta' żibeġ CD3 (Miltenyi). Fil-preżenza jew fin-nuqqas ta' MNA, iċ-ċelloli CD3+ ġew attivati ​​b'CD3 marbut mal-pjanċa (5μg/ml), CD28 solubbli (3μg/ml) u IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Fl-aħħar jum tal-espansjoni, il-vijabbiltà (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) u l-proliferazzjoni (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ġew evalwati permezz ta' ċitometrija tal-fluss. Evalwa l-funzjoni tal-effettur billi tistimula ċ-ċelloli b'PMA (20 ng/ml) u ionomycin (1μg/ml) b'GolgiStop għal 4 sigħat, u mmonitorja CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) u TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Stimula ċ-ċelloli qPCR u ChIP b'PMA (20 ng/ml) u ionomycin (1μg/ml) għal 4 sigħat. Is-supernatant tal-ELISA nġabar qabel u wara l-istimulazzjoni b'PMA (20 ng/ml) u ionomycin (1 μg/ml) għal 4 sigħat.
Segwi l-protokoll tal-manifattur biex tiżola l-RNA bl-użu tal-RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Uża QIAshredder (QIAGEN) biex tomoġenizza l-kampjun. Uża kit ta' RNA għal cDNA ta' kapaċità għolja (Thermo Fisher Scientific) biex tissintetizza DNA komplementari (cDNA). Uża TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) biex tikkwantifika l-espressjoni tal-ġeni (skont il-protokoll tal-manifattur) bis-sondi li ġejjin: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] u Hs01010726_m1 (SLC22A2). Il-kampjuni tħaddmu fuq is-sistema StepOnePlus real-time PCR (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) fil-pjanċa ta' reazzjoni ottika mgħaġġla ta' 96-bir MicroAmp (Applied Biosystems) b'film ottiku MicroAmp. Kwalunkwe valur Ct li jaqbeż il-35 huwa kkunsidrat li huwa 'l fuq mil-limitu ta' skoperta u huwa mmarkat bħala li ma jistax jiġi skopert.
Wettaq ChIP kif deskritt qabel (58). Fil-qosor, iċ-ċelloli ġew ittrattati bil-formaldehyde (konċentrazzjoni finali 1.42%) u inkubati f'temperatura tal-kamra għal 10 minuti. Uża buffer ta' nefħa supplimentat (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl u 0.1% NP-40) fuq is-silġ għal 10 minuti, imbagħad erġa' ssospendi f'buffer ta' immunopreċipitazzjoni kif deskritt (58). Il-kampjun imbagħad ġie sonikatu biċ-ċikli li ġejjin: 10 ċikli (20 pulsazzjoni ta' sekonda) u ħin statiku ta' 40 sekonda. Inkuba l-antikorpi immunoglobulina G ta' grad ChIP (Cell Signaling Technology; 1μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) u SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) mal-kampjun f'4°CC u ħawwad matul il-lejl. Inkuba ż-żibeġ tal-proteina A (Thermo Fisher Scientific) mal-kampjun f'4°C b'ħawwad ġentili għal siegħa, imbagħad uża ż-żibeġ chelex (Bio-Rad) biex tarrikkixxi d-DNA, u uża proteinase K (Thermo Fisher) għad-diġestjoni tal-proteini. Il-promotur TNFα ġie skopert permezz ta' PCR: 'il quddiem, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; għall-kuntrarju, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (prodott ta' 207-bp). L-immaġini ġew prodotti minn Image Lab (Bio-Rad) u kwantifikati bl-użu tas-softwer ImageJ.
Is-supernatant tal-kultura taċ-ċelluli nġabar kif deskritt hawn fuq. Id-determinazzjoni twettqet skont il-proċeduri tal-manifattur tal-kit ELISA tat-TNFα umana (Invitrogen), il-kit ELISA tal-IL-2 umana (Invitrogen) u l-kit ELISA tal-IFN-γ umana (Abcam). Skont il-protokoll tal-manifattur, is-supernatant ġie dilwit 1:100 biex jinstab TNFα u IL-2, u 1:3 biex jinstab IFN-γ. Uża EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) biex tkejjel l-assorbenza f'450 nm.
Il-PBMC ġew separati mill-prodotti tas-separazzjoni tal-lewkoċiti (STEMCELL Technologies) permezz ta' ċentrifugazzjoni tad-densità tal-gradjent ta' Ficoll. Iċ-ċelloli CD3+ ġew iżolati mill-PBMC bl-użu ta' żibeġ CD3 (Miltenyi). Fil-preżenza jew fin-nuqqas ta' MNA, iċ-ċelloli CD3+ ġew attivati ​​b'CD3 marbut mal-pjanċa (5μg/ml), CD28 solubbli (3μg/ml) u IL-2 (300 U/ml; Proleukin) għal 3 ijiem. Wara 3 ijiem, iċ-ċelloli nġabru u nħaslu b'0.9% salina, u l-gerbub ġie ffriżat malajr. L-għadd taċ-ċelloli twettaq permezz ta' ċitometrija tal-fluss (Cytek Aurora; konfigurazzjoni 3L-16V-14B-8R) bl-użu ta' 123count eBeads.
Estratt il-metaboliti kif deskritt hawn fuq. L-estratt imnixxef ġie rikostitwit f'konċentrazzjoni ta' 4000 ekwivalenti ta' ċelluli/μl. Analizza l-kampjun permezz ta' kromatografija ta' fażi inversa (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) u kolonna CORTECS T3 (2.1×150 mm, daqs tal-partiċelli 1.6-μm, daqs tal-pori 120-Å; #186008500, Waters). Spettrometru tal-massa polari (6470, Agilent), li fih l-jonizzazzjoni bl-elettrosprej topera f'modalità pożittiva. Il-fażi mobbli A hija 0.1% aċidu formiku (f'H2O), il-fażi mobbli B hija 90% aċetonitrile, 0.1% aċidu formiku. Il-gradjent LC huwa minn 0 sa 2 minuti għal 100% A, minn 2 sa 7.1 minuti għal 99% B, u minn 7.1 sa 8 minuti għal 99% B. Imbagħad erġa' ekwilibra l-kolonna mal-fażi mobbli A b'rata ta' fluss ta' 0.6 ml/min għal 3 minuti. Ir-rata tal-fluss hija 0.4ml/min, u l-kompartiment tal-kolonna jissaħħan sa 50°C. Uża l-istandard kimiku pur tal-MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) biex tistabbilixxi l-ħin ta' żamma (RT) u t-trasformazzjoni (RT = 0.882 minuti, trasformazzjoni 1 = 137→94.1, trasformazzjoni 2 = 137→92, Konverżjoni 3 = 137→78). Meta t-tliet tranżizzjonijiet iseħħu fil-ħin ta' żamma korrett, it-tranżizzjoni 1 tintuża għall-kwantifikazzjoni biex tiġi żgurata l-ispeċifiċità. Il-kurva standard tal-MNA (Toronto Research Chemical Company) ġiet iġġenerata minn sitt dilwizzjonijiet serjali tas-soluzzjoni stokk (1 mg/ml) biex jinkisbu standards ta' 0.1, 1.0, 10 u 100 ng/ml u 1.0 u 10μg/ml rispettivament likwidu. Il-limitu ta' skoperta huwa 1 ng/ml, u r-rispons lineari huwa bejn 10 ng/ml u 10μg/ml. Kull injezzjoni ta' żewġ mikrolitri ta' kampjun u standard tintuża għall-analiżi LC/MS, u kampjun imħallat ta' kontroll tal-kwalità jitħaddem kull tmien injezzjonijiet biex tiġi żgurata l-istabbiltà tal-pjattaforma tal-analiżi. Ir-risponsi tal-MNA tal-kampjuni kollha taċ-ċelluli ttrattati bl-MNA kienu fil-medda lineari tal-assaġġ. L-analiżi tad-dejta saret bl-użu tas-softwer tal-analiżi kwantitattiva MassHunter (v9.0, Agilent).
It-tieni ġenerazzjoni ta' kostruzzjoni αFR-CAR ittieħdet minn Song et al. (59). Fil-qosor, il-kostruzzjoni fiha l-kontenut li ġej: sekwenza ewlenija CD8a, framment varjabbli ta' katina waħda speċifiku għall-αFR uman, reġjun taċ-ċarniera u transmembrana CD8a, dominju intraċellulari CD27 u dominju intraċellulari CD3z. Is-sekwenza CAR kompluta ġiet sintetizzata minn GenScript, u ​​mbagħad ikklonata fil-vettur ta' espressjoni lentivirali tat-tieni ġenerazzjoni 'l fuq mill-cassette ta' espressjoni GFP użata biex tiġi evalwata l-effiċjenza tat-trażduzzjoni.
Il-lentivirus huwa prodott permezz tat-trasfezzjoni taċ-ċelloli HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); imkabbra f'mezz Eagle modifikat ta' Dulbecco li fih 10% serum bovin fetali (FBS) u 1% PenStrep, u ntuża l-vettur CAR-GFP u l-plasmidi tal-ippakkjar (psPAX2 u pMD2.G, Addgene) jużaw amina tal-lipofezzjoni (Sigma-Aldrich). Is-supernatant li fih il-virus inġabar 48 u 72 siegħa wara t-trasfezzjoni, ġie ffiltrat, u kkonċentrat permezz ta' ultraċentrifugazzjoni. Aħżen is-supernatant virali kkonċentrat f'-80°C sakemm issir it-trasduzzjoni.
Il-PBMC huma separati minn prodotti ta' separazzjoni ta' lewkoċiti ta' donaturi b'saħħithom (STEMCELL Technologies) permezz ta' ċentrifugazzjoni ta' densità ta' gradjent ta' Ficoll. Uża mikrożibeġ CD8 ta' selezzjoni pożittiva (Miltenyi) biex tiżola ċ-ċelloli CD8+ mill-PBMC. Stimula ċ-ċelloli T bi TransAct (Miltenyi) u f'mezz TexMACS [Miltenyi; supplimentat bi 3% serum uman inattivat bis-sħana, 1% PenStrep u IL-2 (300 U/ml)]. Erbgħa u għoxrin siegħa wara l-istimulazzjoni, iċ-ċelloli T ġew trasdotti b'lentivirus (10 μl supernatant tal-virus ikkonċentrat għal kull 106 ċelloli). Minn jum sa tlett ijiem wara t-trasduzzjoni fuq Cytek Aurora (fuq FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), evalwa l-espressjoni tal-GFP taċ-ċelloli biex turi effiċjenza ta' trasduzzjoni ta' mill-inqas 30%.
Iċ-ċelloli CAR-T ġew ikkultivati ​​għal 24 siegħa f'Immunocult (STEMCELL Technologies; supplimentat b'1% PenStrep) taħt il-kundizzjonijiet li ġejjin: mhux trattat, ittrattat b'250 μM adenosine jew 10 mM MNA. Wara t-trattament minn qabel, iċ-ċelloli CAR-T inħaslu bil-PBS u ġew ikkombinati ma' 20,000 ċellula SK-OV-3 [ATCC; f'mezz McCoy 5A (Sigma-Aldrich) supplimentat b'10% FBS u 1% PenStrep f'10: Il-proporzjon tal-effettur għall-mira ta' 1 ġie amplifikat fi triplikat f'mezz Immunocult supplimentat. Iċ-ċelloli SK-OV-3 u ċ-ċelloli SK-OV-3 liżati b'digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) intużaw bħala kontrolli negattivi u pożittivi, rispettivament. Wara 24 siegħa ta' ko-kultivazzjoni, is-supernatant inġabar u l-lactate dehydrogenase (LDH) tkejjel skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Is-supernatant LDH ġie dilwit 1:50 f'buffer LDH. Il-perċentwal tal-qtil tkejjel bl-użu tal-formula li ġejja: perċentwal tal-qtil = perċentwal ta' korrezzjoni / rata massima ta' qtil x 100%, fejn il-perċentwal ta' korrezzjoni = ko-kultura-ċelluli T biss, u r-rata massima ta' qtil = kontroll pożittiv-kontroll negattiv.
Kif deskritt fit-test jew fil-materjali u l-metodi, uża GraphPad Prism 8, Microsoft Excel jew R v3.6.0 għall-analiżi statistika. Jekk jinġabru kampjuni multipli mill-istess pazjent (bħal axxite u tumur), nużaw test t imqabbad jew ninkludu l-pazjent bħala effett każwali f'mudell lineari jew ġeneralizzat kif xieraq. Għall-analiżi metabolomika, it-test tal-importanza jitwettaq fi tliet kopji.
Għal materjali supplimentari għal dan l-artiklu, jekk jogħġbok ara http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Dan huwa artiklu b'aċċess miftuħ imqassam skont it-termini tal-Liċenzja Creative Commons Attribution-Non-Commercial, li tippermetti l-użu, id-distribuzzjoni u r-riproduzzjoni fi kwalunkwe mezz, sakemm l-użu finali ma jkunx għal qligħ kummerċjali u l-premessa hija li x-xogħol oriġinali huwa korrett. Referenza.
Nota: Nitolbuk biss li tipprovdi l-indirizz elettroniku tiegħek sabiex il-persuna li tirrakkomanda lill-paġna tkun taf li tridha tara l-email u li mhijiex spam. Mhux se naqbdu l-ebda indirizz elettroniku.
Din il-mistoqsija tintuża biex tittestja jekk intix viżitatur u tipprevjeni s-sottomissjoni awtomatika ta' spam.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (R. Russell Jones), Ralph J. De Bellardini (R. G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
L-MNA jikkontribwixxi għas-soppressjoni immuni taċ-ċelluli T u jirrappreżenta mira potenzjali ta' immunoterapija għat-trattament tal-kanċer uman.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (R. Russell Jones), Ralph J. De Bellardini (R. G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
L-MNA jikkontribwixxi għas-soppressjoni immuni taċ-ċelluli T u jirrappreżenta mira potenzjali ta' immunoterapija għat-trattament tal-kanċer uman.
©2021 Assoċjazzjoni Amerikana għall-Avvanz tax-Xjenza. id-drittijiet kollha riżervati. AAAS hija sieħba ta' HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef u COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.